基于宏基因組學(xué)方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶資源.pdf

1、α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase EC3.2.1.40）屬于糖苷水解酶類，能夠?qū)Ｒ?、高效水解許多天然糖苷化合物如橙皮苷、蘆丁、柚皮苷和槲皮苷等末端的α-L-鼠李糖基。據(jù)報道該酶可從細(xì)菌，酵母，真菌，植物和動物組織中分離獲得，其應(yīng)用價值在于能將果汁類飲品脫苦，去除飲品中的渾濁，增加酒的香氣，可水解許多天然化合物的鼠李糖苷，作為藥物前體來改善藥物特性等等。
　　本研究通過檢索CAZy數(shù)據(jù)庫，獲得193條細(xì)菌源GH7

2、8家族α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列，經(jīng)氨基酸一級序列同源性多重比對后，根據(jù)α-L-鼠李糖苷酶催化中心殘基廣義酸氨基酸的差異以及廣義酸堿對處保守氨基酸基序特點，將其分為三個亞家族，對其中兩個亞家族的α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列分別再進(jìn)行多重序列比對，在各自廣義酸堿對處分別獲得兩段保守氨基酸基序。
　　利用保守氨基酸基序結(jié)合PCR驅(qū)動的宏基因組學(xué)方法，以提取的健康人體糞便宏基因組DNA為模板，基于保守基序氨基酸序列設(shè)計簡并引物，PCR

3、擴(kuò)增保守基序間基因片段。對PCR產(chǎn)物克隆測序，結(jié)果獲得12條α-L-鼠李糖苷酶基因片段，將其編碼的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對，其中兩條基因片段的氨基酸序列一致性僅為52％，一條為73％，其余九條在94％以上。與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列一致性高(＞94％)的片段，根據(jù)其對應(yīng)全長基因序列設(shè)計上下游引物，對于氨基酸序列一致性為52％的基因片段，通過對樣品進(jìn)行全基因組de novo測序，得其全長基因序列。將獲得的四

4、條α-L-鼠李糖苷酶全長基因，克隆于載體pET-28a，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá)。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析表明，目的蛋白在上清和沉淀中均有表達(dá)。
　　以對硝基苯酚α-L-鼠李糖苷(pNPR)為底物對獲得的粗酶液活性進(jìn)行初步檢測，僅在RhaC目的蛋白的可溶性上清中檢測到活性。隨即利用鎳柱親和層析的方法，對其純化條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，進(jìn)而純化得到高純度的目的蛋白。
　　綜上所述，人體腸道細(xì)菌宏基因