基于宏基因組學(xué)方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶資源.pdf

1、α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase EC3.2.1.40）屬于糖苷水解酶類，能夠?qū)Ｒ?、高效水解許多天然糖苷化合物如橙皮苷、蘆丁、柚皮苷和槲皮苷等末端的α-L-鼠李糖基。據(jù)報(bào)道該酶可從細(xì)菌，酵母，真菌，植物和動(dòng)物組織中分離獲得，其應(yīng)用價(jià)值在于能將果汁類飲品脫苦，去除飲品中的渾濁，增加酒的香氣，可水解許多天然化合物的鼠李糖苷，作為藥物前體來改善藥物特性等等。
　　本研究通過檢索CAZy數(shù)據(jù)庫，獲得193條細(xì)菌源GH7

2、8家族α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列，經(jīng)氨基酸一級(jí)序列同源性多重比對(duì)后，根據(jù)α-L-鼠李糖苷酶催化中心殘基廣義酸氨基酸的差異以及廣義酸堿對(duì)處保守氨基酸基序特點(diǎn)，將其分為三個(gè)亞家族，對(duì)其中兩個(gè)亞家族的α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列分別再進(jìn)行多重序列比對(duì)，在各自廣義酸堿對(duì)處分別獲得兩段保守氨基酸基序。
　　利用保守氨基酸基序結(jié)合PCR驅(qū)動(dòng)的宏基因組學(xué)方法，以提取的健康人體糞便宏基因組DNA為模板，基于保守基序氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR

3、擴(kuò)增保守基序間基因片段。對(duì)PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，結(jié)果獲得12條α-L-鼠李糖苷酶基因片段，將其編碼的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對(duì)，其中兩條基因片段的氨基酸序列一致性僅為52％，一條為73％，其余九條在94％以上。與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列一致性高(＞94％)的片段，根據(jù)其對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，對(duì)于氨基酸序列一致性為52％的基因片段，通過對(duì)樣品進(jìn)行全基因組de novo測(cè)序，得其全長(zhǎng)基因序列。將獲得的四

4、條α-L-鼠李糖苷酶全長(zhǎng)基因，克隆于載體pET-28a，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)進(jìn)行異源表達(dá)。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分析表明，目的蛋白在上清和沉淀中均有表達(dá)。
　　以對(duì)硝基苯酚α-L-鼠李糖苷(pNPR)為底物對(duì)獲得的粗酶液活性進(jìn)行初步檢測(cè)，僅在RhaC目的蛋白的可溶性上清中檢測(cè)到活性。隨即利用鎳柱親和層析的方法，對(duì)其純化條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，進(jìn)而純化得到高純度的目的蛋白。
　　綜上所述，人體腸道細(xì)菌宏基因