黑曲霉JMU--TS528菌株的α--L--鼠李糖苷酶基因的克隆和表達分析.pdf

1、橐簍大學碩士學位論文黑曲霉JMUTS528菌株的僅L鼠李糖苷酶基因的克隆和表達分析CloningandExpressionAnalysisof一■_■JI●●■oaLrnamnoSlaaSeIjenetrom月Spe乃舅“，oS刀埏，eI廠JMUTS528論文答辯日期：壟Q!壘生魚旦墨旦黑曲霉JMUTS528菌株的aL鼠李糖苷酶基因的克隆和表達分析摘要黑曲霉作為重要的酶制劑生產(chǎn)菌種，是美國食品藥品監(jiān)督管理局允許使用的食品用酶生產(chǎn)菌，它能

2、合成一種具有很高商業(yè)價值的水解酶叫L鼠李糖苷酶。目前黑曲霉菌株的aL鼠李糖苷酶產(chǎn)量低、發(fā)酵成本高，且黑曲霉產(chǎn)aL鼠李糖苷酶需要誘導(dǎo)物，同時受到碳源代謝的調(diào)節(jié)。本文結(jié)合重疊PCR和RACE技術(shù)克隆了黑曲霉中的aL鼠李糖苷酶基因(Lrha)，通過建立SYBRGreen實時定量PCR檢測體系和方法探索了黑曲霉中Lrha和葡萄糖抑制基因(CreA)的表達情況，同時構(gòu)建了可持續(xù)表達a—L鼠李糖苷酶的基因工程菌。主要結(jié)果如下：1克隆到編碼黑曲霉JM

3、U—TS528中0【L鼠李糖苷酶的cDNA(KC7509081)，命名為Lrha。該序列長2062bp，3’非編碼區(qū)長94bD，最大開放閱讀框的堿基數(shù)為1968，可編碼655個氨基酸，117個氨基酸是信號肽。L—rha與白曲霉(AB3742671)和黑曲霉51388(煳0013890491)中葉L鼠李糖苷酶基因相似度很高，分別為93％和91％；根據(jù)同源建模的結(jié)果可知，它的空間結(jié)構(gòu)和GH78家族的CtL鼠李糖苷酶相似，具有該家族典型的(“

4、a)6barrel桶狀結(jié)構(gòu)。2黑曲霉JlvlUTS528在以柚皮苷、橘皮苷、蕓香苷和鼠李糖為唯一碳源時可分泌葉L鼠李糖苷酶，以葡萄糖為唯一碳源時檢測不到QL鼠李糖苷酶活性。檢測黑曲霉中的Lrha和CreA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加葡萄糖后，黑曲霉JIVlUTS528發(fā)酵產(chǎn)物中的葉L鼠李糖苷酶活性降低，Lrha表達量降低，CreA表達量上升。3將Lrha連接到表達載體pET32a和pPIC9K，構(gòu)建重組載體pETrha和pPIC9Kr

5、ha，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)和畢赤酵母GSll5進行表達。在兩種表達系統(tǒng)中都能誘導(dǎo)出重組蛋白，但大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)出的是包涵體形式的蛋白，沒有檢測到小L鼠李糖苷酶活性；畢赤酵母工程菌GSll5誘導(dǎo)表達7d后，酶活達到7119U／mL。4重組QL鼠李糖苷酶的最適pH為6O，最適溫度600C，能夠水解袖皮苷、橘皮苷、蕓香苷、楊梅苷及pNPR。1、lo和100mmol／L的Mg、Zn2、Ca2、Cu2、C02、Ni2

6、和K對重組酶有促進作用，l和10m_n[10l／L的Na、葡萄糖、L鼠李糖、EDTA、DTT，10和100mmoI／L的Fe3，1mmol／L的Mn2、10砌【mI／L的SDS、100mmol／L的Fe2十，以及B巰基乙醇(1％、01％)對該酶有較強的抑制的作用。以柚皮苷為底物，在500C、pH50、20mmol／L的檸檬酸鹽緩沖體系中測得重組酶的Km為004mmol／L、Vmax為81193U／mg。關(guān)鍵詞黑曲霉，葉L一鼠李糖苷酶，表