丙型肝炎病毒高變區(qū)1中存在介導(dǎo)病毒入侵和免疫逃避的三個(gè)不同結(jié)構(gòu)域.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)屬于黃病毒科、丙型肝炎病毒屬，為有包膜的單正鏈RNA病毒。目前全球約有1.8億人感染HCV，大多數(shù)為慢性感染，部分感染者可發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。HCV的RNA聚合酶缺少校對(duì)功能，致使HCV整個(gè)基因組具有很高的變異性，但HCV基因的變異呈不平衡分布.位于包膜蛋白2(E2)氨基端的27個(gè)氨基酸殘基變異性最為突出，即HVR1。HVR1高度暴露于包膜蛋白表面，其中含有中和抗體表位，可以

2、誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)該區(qū)域的抗體，產(chǎn)生的抗體可以高效中和HCV的感染，但HVR1的基因序列高度變異，先前由宿主免疫細(xì)胞產(chǎn)生的抗體不能識(shí)別變異后的HVR1，因此病毒得以逃避宿主細(xì)胞的免疫監(jiān)控并在病人體內(nèi)持續(xù)感染進(jìn)而使感染慢性化。眾多實(shí)驗(yàn)室都將HVR1作為HCV疫苗研發(fā)的重要靶標(biāo)，但自1989年丙型肝炎病毒首次命名至今，仍沒有一個(gè)真正有效的保護(hù)性疫苗問世。
　　 HCV感染會(huì)引起肝內(nèi)生化代謝紊亂，包括脂質(zhì)代謝障礙和載脂蛋白合成異常，與其

3、他病毒性肝炎相比，HCV感染慢性化后，中重度肝細(xì)胞脂肪變性包括胞質(zhì)內(nèi)脂滴聚集是其典型組織病理學(xué)特征。HCV是有包膜RNA病毒，其表面有不同數(shù)量的脂蛋白包裹，所以病人血清中純化得到的HCV病毒顆粒呈現(xiàn)不同的密度分布，并且不同密度的病毒顆粒感染性也不同。有研究發(fā)現(xiàn)HVR1的刪除會(huì)導(dǎo)致低密度病毒顆粒數(shù)目下降，也就是減弱了HCV的脂蛋白結(jié)合能力，可見HVR1在病毒與脂蛋白結(jié)合的過程中亦發(fā)揮重要的作用。多項(xiàng)研究證明HVR1同時(shí)還在與宿主SR-BI

4、受體結(jié)合以及介導(dǎo)病毒入侵的過程中起關(guān)鍵作用，HVR1具有如此重要的生物學(xué)功能，那么其結(jié)構(gòu)必然具有相對(duì)穩(wěn)定性和保守性，雖然HVR1是HCV基因組中變異頻率最高的部分之一，但對(duì)HCV一系列分離株的序列分析表明一些氨基酸殘基的位點(diǎn)是高度、或者相對(duì)保守的。盡管人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HVR1同時(shí)行駛著誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，脂蛋白結(jié)合以及介導(dǎo)病毒與受體結(jié)合的多重功能，但目前尚不清楚其結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
　　 一、 HCV高變區(qū)1中介導(dǎo)病毒細(xì)胞入

5、侵關(guān)鍵氨基酸殘基的鑒定
　　 首先我們以HCVpp作為研究模型，以HCV1a亞型的H77株為模式株，用單一氨基酸殘基刪除掃描的方法分析HVR1中27個(gè)氨基酸殘基分別對(duì)HCV細(xì)胞入侵的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確的鑒定出HVR1中介導(dǎo)HCV細(xì)胞入侵的關(guān)鍵氨基酸殘基(Ala-14，Gly-15，Lys-25，Gln-26以及Asn-27)，其中任意一個(gè)殘基的刪除對(duì)HCVpp感染性的影響都是致命的，相比之下，其他22個(gè)氨基酸殘基的刪除對(duì)HCVp

6、p感染性并未造成明顯影響。再用HCV入侵相關(guān)受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行機(jī)制分析，我們證明這5位氨基酸殘基介導(dǎo)了病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞SR-BI受體的結(jié)合。氨基酸殘基合并刪除實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的證明了我們的結(jié)論，HVR1氨基端13個(gè)殘基的刪除以及第16-24位9個(gè)氨基酸殘基的刪除不會(huì)顯著降低HCVpp的感染力。除了決定HCV細(xì)胞入侵的5個(gè)氨基酸殘基之外，HVR1氨基端的13個(gè)氨基酸殘基可以通過適當(dāng)?shù)耐蛔?，增?qiáng)病毒與受體的結(jié)合能力從而增強(qiáng)病毒的細(xì)胞入侵能力，

7、并且這一區(qū)域適當(dāng)?shù)耐蛔冞€可以增強(qiáng)病毒的抗中和能力從而更利于病毒的免疫逃避和持續(xù)感染。
　　 二、 HCV高變區(qū)1中誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的抗原表位的鑒定
　　 我們將HVR1分為氨基段，中段和羧基段三部分肽段分別與TRX融合表達(dá)后免疫家兔來檢測(cè)HVR1的27個(gè)氨基酸殘基在誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)過程中是否存在差異，我們發(fā)現(xiàn)HVR1的氨基端13個(gè)氨基酸殘基不能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體，而第16到24位的9個(gè)氨基酸殘基是HVR1中唯一的中和表位，

8、這9個(gè)氨基酸殘基對(duì)于病毒細(xì)胞入侵無關(guān)緊要，但含有肝素結(jié)合位點(diǎn)，有利于HCV的粘附，更為重要的是，高密度脂蛋白(HDL)介導(dǎo)的HCV感染增強(qiáng)作用依賴于該9個(gè)氨基酸殘基的存在，該九個(gè)殘基還可通過與HDL的作用顯著下調(diào)E2抗體的中和活性，小鼠DNA免疫試驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的結(jié)論。
　　 三、 HCV高變區(qū)1中介導(dǎo)病毒顆粒與脂蛋白結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域的鑒定
　　 將濃縮的HCVcc進(jìn)行碘克沙醇密度梯度離心，發(fā)現(xiàn)密度偏低的病毒顆粒具有強(qiáng)

9、感染性，而隨著HCVcc病毒顆粒密度的升高，其感染性也逐漸降低。此外，HDL對(duì)不同密度HCVcc感染的促進(jìn)作用差異顯著，其對(duì)低密度以及中等密度HCVcc感染的促進(jìn)作用不明顯，卻顯著增強(qiáng)高密度HCVcc的感染性。先前我們已證明HVR1中存在一個(gè)由9個(gè)氨基酸殘基組成的功能結(jié)構(gòu)域是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體的主要抗原表位，并且HDL介導(dǎo)的HCV感染增強(qiáng)作用依賴于該9個(gè)氨基酸殘基的存在，本部分實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)刪除了這9個(gè)氨基酸殘基后，HCVcc病毒顆粒的密度

10、分布曲線發(fā)生了明顯改變，低密度的病毒顆粒數(shù)目明顯下降，并且感染性也顯著降低，而更多的病毒顆粒則集中在密度偏高幾層，這和刪除了整個(gè)HVR1的HCVcc所呈現(xiàn)出的病毒密度曲線趨勢(shì)幾乎是一致，這說明在HVR1中，決定HCV病毒顆粒與脂蛋白結(jié)合的關(guān)鍵部位恰恰就是這個(gè)由9個(gè)氨基酸殘基組成的抗原決定區(qū)。在HDL對(duì)不同密度病毒顆粒的感染增強(qiáng)試驗(yàn)中，刪除了9個(gè)氨基酸殘基的任何密度層病毒顆粒的感染性均不再被HDL所增強(qiáng)。
　　 小結(jié)
　　

11、 我們鑒定出HVR1中至少存在三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，它們之間相互協(xié)調(diào)發(fā)揮著微妙的作用:HVR1的抗原決定區(qū)在病毒顆粒表面形成一個(gè)高度凸起，在脂蛋白結(jié)合過程中行駛一個(gè)非特異性“脂抓手”作用，結(jié)合在病毒顆粒表面的脂蛋白又通過與宿主SR-BI受體的結(jié)合拉近病毒顆粒與靶細(xì)胞的空間距離，使得抗原決定區(qū)兩側(cè)的SR-BI結(jié)合位點(diǎn)更易于與SR-BI受體結(jié)合并啟動(dòng)HCV細(xì)胞入侵的一系列步驟;更為有意思的是抗原決定區(qū)的空間凸起又是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體的關(guān)鍵抗原表位，

12、但其自身又呈現(xiàn)了高度的變異，使得宿主產(chǎn)生的抗體不能識(shí)別宿主體內(nèi)新釋放出的病毒顆粒，從而達(dá)到免疫逃避和持續(xù)感染的目的;而恰恰也是這樣一個(gè)抗原表位，因?yàn)槠渥陨淼目臻g高度凸起，使得HCV病毒顆粒表面包裹著大量的脂蛋白，脂蛋白覆蓋住了HCV病毒顆粒表面其他真正意義上的保守中和抗體表位，使得宿主細(xì)胞不能大量產(chǎn)生可以識(shí)別病毒顆粒表面保守位點(diǎn)的中和抗體，我們認(rèn)為這個(gè)“脂抓手”同時(shí)又起到了“免疫誘餌”的作用。人們往往將HVR1的27個(gè)氨基端殘基作為一個(gè)