脂筏對(duì)丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒和腸道病毒71型細(xì)胞入侵的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞膜中有一類特殊的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，富含膽固醇和磷鞘脂，在細(xì)胞膜上呈島狀分布，如漂浮在甘油磷脂海洋上的木筏，因此被稱為“脂筏”(lipid raft)。脂筏是細(xì)胞進(jìn)行多種生命活動(dòng)的活躍區(qū)域，通過為蛋白質(zhì)的相互作用提供募集平臺(tái)，在跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜運(yùn)輸分選、細(xì)胞骨架重建等過程中都發(fā)揮重要的作用。
　　 作為病毒感染的首要環(huán)節(jié)，入侵在病毒整個(gè)生活周期中具有舉足輕重的作用，也是抗病毒研究策略的重要靶標(biāo)。病毒入侵宿主細(xì)胞必須經(jīng)過以下幾個(gè)步驟：

2、
　　 (1)吸附到宿主細(xì)胞表面；
　　 (2)穿入細(xì)胞質(zhì)或內(nèi)含體；
　　 (3)脫殼。
　　 病毒為了完成從胞外到胞內(nèi)的穿膜過程，往往利用宿主細(xì)胞膜上的某些結(jié)構(gòu)域或微環(huán)境。目前研究證實(shí)，作為細(xì)胞膜的重要組成部分，脂筏是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的活躍區(qū)域。
　　 脂筏調(diào)節(jié)包膜病毒細(xì)胞入侵的機(jī)制大致有四種：
　　 (1)病毒包膜蛋白錨固于脂筏中；
　　 (2)病毒受體為脂筏定位；

3、>　　 (3)基于脂筏的病毒包膜蛋白構(gòu)象變化或膜融合；
　　 (4)脂筏依賴的病毒內(nèi)吞。
　　 人免疫缺陷病毒(HIV)是一個(gè)研究得較清楚、被歸為脂筏病毒的包膜病毒：HIV包膜蛋白gp120與脂筏中的膽固醇結(jié)合，其受體CD4及輔助受體CCR5均為脂筏蛋白；一些靶向脂筏的化合物也顯現(xiàn)出很強(qiáng)的抗HIV活性，提示了以脂筏作為抗病毒藥物靶點(diǎn)的可能性。然而，不同的包膜病毒識(shí)別不同的受體，膜融合觸發(fā)機(jī)制又有pH依賴和非依賴之分，因

4、此包膜病毒利用脂筏完成有效入侵的方式也各不相同。了解脂筏在病毒細(xì)胞入侵中的作用環(huán)節(jié)，可針對(duì)性地設(shè)計(jì)和研發(fā)抗病毒藥物。
　　 相對(duì)于包膜病毒膜融合觸發(fā)機(jī)制的深入研究，非包膜病毒的細(xì)胞入侵機(jī)制知之甚少。目前研究發(fā)現(xiàn)，有些非包膜病毒通過脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞方式進(jìn)入靶細(xì)胞，比如腸道病毒1型(Echovirus 1，EV1)、猿猴病毒40(Simian Virus 40,SV40)等；有些則通過與定位在脂筏上的受體結(jié)合而啟動(dòng)病毒入侵，如：柯薩奇

5、病毒(Coxsackieviruses)、輪狀病毒(Rotavirus)等。因此，探索脂筏調(diào)控病毒感染的膜上事件，有利于進(jìn)一步闡明病毒細(xì)胞入侵的分子機(jī)制。
　　 細(xì)胞膜是阻斷病毒感染靶細(xì)胞的第一道屏障。本課題從細(xì)胞膜脂筏入手，以三種單正鏈RNA病毒為研究對(duì)象，包括有包膜的丙型肝炎病毒、日本腦炎病毒以及無包膜的腸道病毒71型，研究脂筏調(diào)節(jié)病毒與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，探討不同病毒利用脂筏完成細(xì)胞入侵的區(qū)別與聯(lián)系。
　　

6、 一、脂筏影響丙型肝炎病毒細(xì)胞入侵的機(jī)制研究
　　 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)屬于黃病毒科、丙型肝炎病毒屬，為有包膜的單正鏈RNA病毒。其包膜蛋白E1和E2存在于病毒顆粒的表面，是介導(dǎo)病毒吸附和進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白。隨著HCV體外感染模型HCVpp和HCVcc系統(tǒng)的建立與完善，已經(jīng)鑒定出了HCV的四個(gè)必需受體：四次跨膜蛋白CD81、B族Ⅰ型清道夫受體(SR-BI)、以及緊密連接分子claudin

7、-1(CLDNl)和occludin(OCLN)。其中，CD81是最先被鑒定出的受體，其胞外大環(huán)能夠直接與HCVE2蛋白結(jié)合；結(jié)合后激活相關(guān)信號(hào)通路，引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重建，介導(dǎo)病毒體向緊密連接處移動(dòng)，并與共受體CLDN1相互作用，在后者幫助下完成內(nèi)吞?，F(xiàn)有研究表明，HCV細(xì)胞入侵過程依賴于細(xì)胞膜上完整的脂筏結(jié)構(gòu)，然而其機(jī)制尚不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在HCV入侵過程中，CD81分布于細(xì)胞膜脂筏中；而膽固醇刪除后改

8、變CD81分布模式，使其定位于非脂筏區(qū)域，提示CD81脂筏分布可能為HCV細(xì)胞入侵所必需。為進(jìn)一步分析CD81脂筏定位的重要作用，本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了CD81脂筏定位和非脂筏定位的突變體真核表達(dá)質(zhì)粒。這些突變體保留了CD81與HCVE2相互作用的胞外大環(huán)，而將其跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)置換為脂筏蛋白(SR-BI和CD9)或非脂筏蛋白(CD71)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)。繼而將質(zhì)粒(野生型wtCD81、CD9-81LEL、SRBI-81LEL和CD71-81LEL)

9、轉(zhuǎn)染CD81缺陷的Huh7細(xì)胞(Huh7 CD81-細(xì)胞)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)證明，置換胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)不影響CD81分子的膜上表達(dá)和空間構(gòu)象。通過蔗糖密度梯度超速離心分離靶細(xì)胞脂筏后發(fā)現(xiàn)，wtCD81、CD9-81LEL、SRBI-81LEL定位在脂筏中，而CD71-81LEL為非脂筏定位，提示CD81跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)具有脂筏定位功能。利用HCV體外感染模型HCVpp和HCVcc系統(tǒng)，比較各CD81突變體介導(dǎo)HCV細(xì)胞入侵以及感染的能力。結(jié)果

10、顯示，除非脂筏定位的CD71-81LEL外，其余脂筏定位的CD81突變體均能有效支持HCV細(xì)胞入侵。在此基礎(chǔ)上，我們通過觀察比較不同脂筏定位的CD81分子在病毒結(jié)合、GTPase Rho信號(hào)通路激活、細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重建、介導(dǎo)病毒向細(xì)胞緊密連接處遷移并形成HCV-CD81-CLDN1等功能的影響，分析細(xì)胞膜脂筏參與HCV細(xì)胞入侵過程的分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非脂筏定位的CD71-81LEL突變體結(jié)合病毒的能力并未改變，但卻不能介導(dǎo)HCV與共

11、受體CLDN1相互作用。進(jìn)一步通過Western blotting和激光共聚焦研究發(fā)現(xiàn)，CD71-81LEL不能介導(dǎo)HCV感染的機(jī)制是由于其定位在非脂筏區(qū)域無法激活GTPase Rho信號(hào)通路，引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白重建所致。
　　 二、脂筏對(duì)日本腦炎病毒細(xì)胞入侵的影響及其機(jī)制研究
　　 日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)又稱流行性乙型腦炎病毒，屬于黃病毒屬(Flavivirus

12、)，和HCV一樣同為黃病毒科成員，是有包膜的單股正鏈RNA病毒。有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞膜脂筏在JEV細(xì)胞入侵以及復(fù)制周期中扮演了重要角色，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究?？紤]到病毒受體在病毒與脂筏相互作用中的樞紐功能，本研究將人肝癌細(xì)胞株Huh7細(xì)胞為研究對(duì)象，以JEV為感染材料，分析熱休克蛋白70(HSP70)作為JEV受體在介導(dǎo)病毒細(xì)胞入中侵的作用，并通過觀察HSP70脂筏定位對(duì)于JEV感染性的影響，探討脂筏參與JEV入侵的分子機(jī)制。

13、　　 本研究通過一系列功能性實(shí)驗(yàn)，觀察HSP70是否為JEV感染Huh7細(xì)胞所必需。首先，在病毒感染前將HSP70多克隆抗體預(yù)先與Huh7細(xì)胞孵育，JEV感染24h后，用間接免疫熒光染色檢測(cè)JEVE蛋白表達(dá)，同時(shí)用空斑實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞上清中的病毒進(jìn)行定量。結(jié)果顯示，HSP70多克隆抗體可顯著抑制JEVE蛋白表達(dá)，并且這種抑制作用呈明顯的劑量依賴性?？瞻邔?shí)驗(yàn)結(jié)果得出同樣的結(jié)論：隨著抗體濃度的增加，細(xì)胞上清中JEV感染滴度逐漸下降；在加入10μ

14、g/ml濃度抗體時(shí)，病毒滴度下降了100倍。其次，作為病毒受體必需在細(xì)胞膜表面表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證明HSP70確實(shí)存在于Huh7細(xì)胞表面。接著，將病毒與Huh7細(xì)胞于4℃共同孵育，通過免疫沉淀HSP70,觀察沉淀復(fù)合物中是否存在JEVE蛋白，結(jié)果表明HSP70抗體的沉淀復(fù)合物中確實(shí)存在JEV包膜蛋白。這些結(jié)果提示，HSP70是介導(dǎo)JEV感染Huh7細(xì)胞的一個(gè)重要的細(xì)胞膜分子。HSP70家族由幾個(gè)高度保守的熱休克蛋白組成，包括HSP70

15、、HSC70、GRP75和GRP78。由于多克隆抗體可能對(duì)HSP70家族不同的蛋白存在交叉反應(yīng)性，因此我們通過特異性的單克隆抗體來觀察參與JEV感染的熱休克蛋白究竟是HSP70家族的哪個(gè)成員?？贵w抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在JEV感染過程中發(fā)揮作用的是HSP70,而非HSC70和GRP78。此外，我們應(yīng)用特異性siRNA的抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)上述結(jié)果加以驗(yàn)證，排除了HSP70家族其他成員作為JEV感染Huh7細(xì)胞受體的可能性。
　　 為觀察具有J

16、EV受體功能的HSP70是否定位于脂筏中，本研究對(duì)Huh7細(xì)胞進(jìn)行了脂筏分離。結(jié)果顯示，天然狀態(tài)下，少量HSP70定位于Huh7細(xì)胞的脂筏結(jié)構(gòu)中；而JEV感染后，HSP70則向細(xì)胞膜脂筏聚集，提示HSP70可被JEV招募至脂筏中。應(yīng)用膽固醇刪除劑干擾脂筏后，顯著抑制JEV細(xì)胞入侵。通過對(duì)其機(jī)制分析，發(fā)現(xiàn)干擾脂筏不影響病毒結(jié)合，但改變了HSP70的脂筏定位。因此，我們推測(cè)脂筏刪除對(duì)JEV感染性的影響可能是由于抑制了HSP70的受體功能。一

17、系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JEV感染早期會(huì)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，并且這種激活作用是由HSP70結(jié)合JEV后引起；而刪除膽固醇后，HSP70對(duì)此通路的激活作用被抑制，提示HSP70發(fā)揮受體功能需依賴于完整的脂筏結(jié)構(gòu)。
　　 三、脂筏對(duì)腸道病毒71型細(xì)胞入侵的影響及其機(jī)制研究
　　 腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是單股正鏈RNA病毒，無包膜，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)

18、腸道病毒屬(Enterovirus)。EV71是引起嬰幼兒手足口病(hand-foot-mouse disease，HFMD)的主要病原體之一。目前還沒有針對(duì)EV71的特效藥物，也沒有預(yù)防性或治療性疫苗問世。EV71的衣殼蛋白VP1是EV71的主要抗原表位和分型依據(jù)，也是EV71與宿主細(xì)胞上受體分子相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。人胚橫紋肌肉瘤細(xì)胞株RD細(xì)胞是EV71的易感細(xì)胞，宿主細(xì)胞上的B族Ⅱ型清道夫受體(SR-BⅡ)為其必需受體。許多腸道病毒

19、，比如脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)、柯薩奇病毒(Coxsackieviruses)以及?？刹《?Echovirus)等，在入侵靶細(xì)胞的過程中都依賴于完整的細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)。然而，細(xì)胞膜脂筏在EV71感染過程中的作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 MβCD是最常見的干擾脂筏的藥物，其作用機(jī)制是特異性的刪除或驅(qū)散細(xì)胞膜上的膽固醇。Nystatin通過與膽固醇結(jié)合形成復(fù)合物而封閉脂筏，Lovastatin則能夠直接抑制細(xì)胞合成膽固醇，

20、都被用作干擾脂筏的藥物而被廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將不同機(jī)制干擾脂筏的藥物預(yù)先與RD細(xì)胞孵育，然后加入病毒，通過以下三種方法分析脂筏對(duì)EV71感染性的影響：
　　 (1)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)；
　　 (2)qRT-PCR檢測(cè)RD細(xì)胞中EV71RNA拷貝數(shù)；
　　 (3)收集細(xì)胞上清，用空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。
　　 結(jié)果顯示，MβCD、nystatin和lovastatin均能顯著抑制EV71引起的細(xì)胞病

21、變效應(yīng)、病毒RNA拷貝數(shù)和上清中的病毒滴度，并呈明顯的劑量依賴性。為進(jìn)一步證明脂筏對(duì)于EV71感染性的影響，我們給RD細(xì)胞外源補(bǔ)充膽固醇。結(jié)果顯示，膽固醇加入后能夠促進(jìn)靶細(xì)胞對(duì)于EV71的易感性。這些結(jié)果提示，EV71利用細(xì)胞膜脂筏感染RD細(xì)胞。
　　 為研究脂筏在EV71細(xì)胞入侵過程中的作用機(jī)制，我們首先觀察MβCD是否影響病毒與受體的相互作用，檢測(cè)了MβCD對(duì)膜表面SR-BⅡ表達(dá)、病毒與SR-BⅡ相互作用、病毒與靶細(xì)胞結(jié)合以

22、及病毒-受體脂筏定位的影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，MβCD作用前后RD細(xì)胞膜上SR-BⅡ表達(dá)量無明顯差異，結(jié)合在細(xì)胞表面的膜上病毒量也沒有減少。免疫共沉淀和Western blotting結(jié)果顯示，EV71與SR-BⅡ的相互作用不受MβCD影響。然而，脂筏分離結(jié)果表明，MβCD干擾脂筏改變了病毒與SR-BⅡ的脂筏分布。由于EV71的內(nèi)吞是由SR-BⅡ介導(dǎo)完成的，因此我們推測(cè)MβCD很可能影響了病毒內(nèi)吞。為觀察干擾脂筏對(duì)EV71內(nèi)吞的影響，

23、在MβCD處理過的RD細(xì)胞中加入病毒于4℃孵育；再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37℃使病毒內(nèi)吞；分別在轉(zhuǎn)移37℃后10min、30min和60min將細(xì)胞固定，進(jìn)行間接免疫熒光染色和激光共聚焦掃描。結(jié)果顯示，在MβCD處理后，胞漿中檢測(cè)不到內(nèi)吞的病毒顆粒，提示干擾脂筏能夠抑制EV71的內(nèi)吞過程。
　　 由于SR-BⅡ并不是EV71感染RD細(xì)胞的唯一受體，還可能有其他共受體或宿主因子參與病毒入侵過程，因此脂筏調(diào)節(jié)病毒與宿主細(xì)胞相互作用的精確分子機(jī)

24、制尚需進(jìn)一步研究證明。
　　 小結(jié)
　　 本研究為脂筏參與HCV、JEV和EV71細(xì)胞入侵提供了直接證據(jù)，進(jìn)一步闡明了這三種病毒細(xì)胞入侵的分子機(jī)制。置換CD81跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)改變其脂筏定位的方法，為研究其他受體分子在介導(dǎo)病毒入侵中的作用提供了借鑒。證明了HSP70具有作為JEV感染Huh7細(xì)胞的受體功能，并且依賴脂筏介導(dǎo)病毒入侵。闡明了非包膜病毒EV71利用脂筏完成病毒入侵及其機(jī)制。
　　 本研究通過分析脂筏在三