腸道病毒71型的層析純化.pdf

1、手足口病是兒童流行疾病中比較常見的疾病之一,許多種腸道病毒都可以引起手足口病,近幾年來在我國(guó)以腸道病毒71型(EV71)為主要的病原體。自1997年以來,EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),甚至引起了嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染或死亡,引起了人們的密切關(guān)注。由于目前還沒有針對(duì)EV71病毒的特效藥和疫苗,因此,研發(fā)一種能有效控制EV71病毒流行的疫苗已經(jīng)勢(shì)在必行。本研究的目的是為建立純化EV71病毒工藝,為以后制備EV71病毒的疫苗提

2、供可靠的研究數(shù)據(jù)。
　　 本研究以EV71病毒粗提液做為研究的材料,建立了凝膠過濾層析和離子交換層析相結(jié)合的純化工藝,為EV71病毒純度的提高提供了最佳的層析參數(shù)。首先,對(duì)Sepharose4 Fast Flow凝膠過濾層析參數(shù)的篩選,選用不同的洗脫流速、不同的樣品上樣量、不同緩沖溶液的pH值和不同鹽濃度對(duì)EV71病毒粗提液進(jìn)行連續(xù)洗脫。結(jié)果表明凝膠過濾層析的洗脫流速、樣品上樣量、緩沖溶液的pH值和鹽濃度對(duì)EV71病毒均能不同程

3、度地影響EV71病毒的分粗提液的分離效果。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),選擇洗脫流速為60cm/h、樣品的上樣量為5％CV、緩沖溶液的pH值為7.5和鹽濃度為0.1mol/L時(shí),對(duì)EV71病毒原液的分離效果比較理想。接著選用了QSepharose XL陰離子膠作為層析介質(zhì)來純化EV71病毒原液。影響離子交換層析的因素有離子強(qiáng)度、pH、溫度和流速等,本文主要探討了離子強(qiáng)度和pH對(duì)離子交換制備EV71病毒的影響。先采用線性梯度洗脫法,初步篩選制備EV71病

4、毒平衡緩沖液含氯化鈉的濃度范圍和洗脫緩沖液中氯化鈉的濃度;然后在同一pH條件下,改變平衡緩沖液中氯化鈉的含量,計(jì)算在每種平衡緩沖液下EV71病毒的效價(jià)和滴度,選擇最佳的平衡緩沖液的氯化鈉的含量;再在同一離子強(qiáng)度條件下,改變pH值,通過計(jì)算EV71病毒的效價(jià)和滴度,選擇最佳pH值。最后通過正交法去驗(yàn)證了不同離子強(qiáng)度和pH值組合,從而篩選出了最佳層析參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)可以看出離子強(qiáng)度和pH值均能不同程度地影響EV71病毒的制備。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),平衡