腸道病毒71型2A蛋白在病毒復(fù)制能力與毒力中的作用.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是手足口?。╤and，foot and mouthdisease，HFMD）的主要病原體之一，屬于小RNA病毒（Picornaviridae）科，腸道病毒（Enterovirus）A屬（speciesA），具有嗜神經(jīng)性，主要感染嬰幼兒和五歲以下兒童。EV71感染造成的HFMD臨床癥狀呈現(xiàn)多樣化，一般僅表現(xiàn)為患者手、足、口部位的皮疹和皰疹等，為自限性疾病，但嚴重時可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)（c

2、entral nervous system，CNS）并發(fā)癥，包括脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、無菌性腦膜炎、腦干腦炎等，甚至造成死亡。EV71全長基因組約為7.4kb，僅有一個開放閱讀框架（open reading fragment，ORF），兩端分別為3'UTR和5'UTR區(qū)。目前，EV71的致病機制仍不明確，我們之前的研究表明EV71的復(fù)制能力與病毒毒力相關(guān)。本研究利用反向遺傳技術(shù)，將EV71山東分離株SDLY107株（分離自死亡患兒）與SDL

3、Y1株（分離自輕癥HFMD患兒）的2A蛋白進行置換后，構(gòu)建了具有感染性的嵌合病毒，研究2A蛋白在病毒復(fù)制能力和毒力中發(fā)揮的作用。
　　目的:
　　1.對EV71不同毒力表型株（SDLY107株和SDLY1株）的2A進行置換，構(gòu)建出EV71嵌合體的感染性克隆cDNA，從而拯救出嵌合病毒株SDLY107-2A-1;
　　2.研究原毒株和嵌合毒株在體外和體內(nèi)復(fù)制能力的差異，以期得到2A對病毒復(fù)制能力的影響;
　　3.通

4、過體外和體內(nèi)實驗研究原毒株和嵌合毒株對細胞和乳鼠器官損傷作用，以期得到2A對病毒毒力的影響。
　　方法:
　　1.利用重疊PCR的方法，設(shè)計合適的引物，獲得SDLY1株的2A基因片段，雙酶切后置換到含有SDLY107株全長的質(zhì)粒pMD-19T中，利用體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA后，轉(zhuǎn)染至Vero細胞，觀察到明顯細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)后，盲傳三代，拯救出嵌合病毒SDLY107-2A-1株;

5、>　　2.用EV71通用引物EV71-S和EV71-A擴增嵌合毒株的VP1片段，凝膠電泳進行鑒定;以SDLY107株免疫ICR小鼠獲得的抗血清作為一抗，利用間接免疫熒光和免疫印跡等方法對嵌合病毒株進行鑒定，測序驗證后，用50％中點法和空斑試驗測定病毒滴度;
　　3.將強毒株SDLY107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY107-2A-1株分別感染細胞48h后，利用LDH試驗和CCK-8試驗檢測不同毒株感染Vero細胞和RD細

6、胞造成的細胞損傷差異;
　　4.將強毒株SDLY107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY107-2A-1株分別感染細胞，在不同溫度下（37℃和39℃）進行培養(yǎng)，每12h取一次上清，連續(xù)取樣5d，樣本統(tǒng)一凍存于-80℃。取樣完成后，提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用實時熒光定量PCR(real time reverse transcription polymerase chainreaction，qRT-PCR)檢測病毒

7、體外動力學(xué)曲線，比較不同毒株在體外的復(fù)制動力學(xué)差異;
　　5.將一日齡ICR乳鼠分為8組，每組11只，實驗組乳鼠分別用SDLY107株、SDLY1株、SDLY107-2A-1株感染，每株病毒接種兩組，另設(shè)兩組對照組;另將一周齡ICR乳鼠分為5組，每組11只，將SDLY107株、SDLY1株、SDLY107-2A-1株分別感染一組一周齡ICR乳鼠，另設(shè)一組對照組;感染途徑為腹腔注射，其中對照組用生理鹽水注射;每天觀察一日齡乳鼠感染組

8、及對照組的臨床體征并記錄乳鼠體重;
　　6.在感染后0d～11d連續(xù)采集乳鼠后肢肌肉組織，提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用qRT-PCR檢測病毒在體內(nèi)復(fù)制曲線;在感染后1d、5d和9d采集乳鼠肺組織、腦組織、后肢肌肉組織和小腸組織，HE染色觀察乳鼠器官病變情況，免疫組化實驗檢測病毒抗原;
　　結(jié)果:
　　1.PCR、間接免疫熒光、免疫印跡及測序證明嵌合病毒拯救成功，且測出SDLY107株、SDLY1株、SDLY

9、107-2A-1株滴度分別為2.22×105PFU/ml、0.65×105PFU/ml、1.25×105PFU/ml;
　　2.LDH實驗和CCK-8實驗表明嵌合毒株SDLY107-2A-1株對細胞的損傷作用弱于強毒株SDLY107株，強于弱毒株SDLY1株(P＜0.05);
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示嵌合毒株SDLY107-2A-1株在體外37℃和39.5℃條件下復(fù)制能力均弱于強毒株SDLY107株，強于弱毒株SDLY

10、1株;嵌合毒株在乳鼠體內(nèi)復(fù)制能力弱于強毒株，強于弱毒株;
　　4.HE病理染色情況和免疫組化實驗結(jié)果表明嵌合毒株對一日齡乳鼠器官造成的病理損傷介于強毒株和弱毒株之間;在乳鼠后肢肌肉組織中可檢測出嵌合毒株、強毒株及弱毒株的抗原，在腦組織中僅可檢測到嵌合毒株和強毒株的抗原。
　　結(jié)論:
　　1.成功拯救了嵌合體病毒SDLY107-2A-1株，其產(chǎn)生的細胞病變效應(yīng)和親本病毒株SDLY107株相似;
　　2.EV71嵌合

11、毒株和親本毒株在體內(nèi)外復(fù)制能力均有差異，表明2A蛋白在病毒復(fù)制能力過程中發(fā)揮作用，但2A蛋白并不是溫度敏感位點;
　　3.EV71嵌合毒株和親本毒株對細胞和乳鼠器官組織的損傷作用均有差異，表明2A蛋白在病毒毒力中為關(guān)鍵蛋白;
　　4.嵌合毒株和強毒株均可在腦中復(fù)制，但弱毒株在腦中沒有復(fù)制能力，這些結(jié)果說明2A蛋白并不能影響病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)和在腦內(nèi)復(fù)制的能力，這說明EV71是通過2A以外的機制侵入神經(jīng)系統(tǒng)，這進一步說明了EV7