腸道病毒71型病毒樣顆粒的制備、純化與鑒定.pdf

1、手足口病是嬰幼兒的一種常見傳染病。EV71是引起患者手足口病的主要病原體之一,同時還能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹等多種與神經系統相關的疾病,嚴重威脅了兒章的生命健康,預防EV71的流行十分重要。據統計,2009年我國共報告手足口病病例約115.5萬例(不含港、澳、臺),死亡病例353例,占我國丙類傳染病發(fā)病數第一位。至今尚無有效的針對性的疫苗預防EV71的感染,只能提高監(jiān)測的強度和靈敏度,早發(fā)現,早治療。因此研制針對

2、EV71的預防性疫苗對控制嬰幼兒手足口病的流行具有十分重要的意義。
　　 本課題選擇利用釀酒酵母表達系統發(fā)酵表達EV71 VLP。首先參照釀酒酵母基因中的優(yōu)勢密碼子,運用分子生物學技術對EV71 P1和3CD基因進行設計和全基因合成。將合成的基因序列克隆到釀酒酵母表達載體上,轉化釀酒酵母進行誘導表達。同時擴增EV71 VP1、VP2、VP3和VP4四個基因,克隆到釀酒酵母表達載體上,轉化釀酒酵母進行誘導表達。其次,對誘導后的酵母

3、細胞進行破碎,利用蛋白沉淀、氯化銫密度梯度離心等純化方法初步純化分離VLP。對純化后樣品進行Western Blot檢測鑒定;并通過負染電鏡觀察VLP。
　　 本課題利用兩種方法在釀酒酵母中表達EV71 VLP:1.將VP1、VP2、VP3和VP4四個基因共同轉化酵母細胞,可以在釀酒酵母細胞中表達,并自行組裝成VLP。2.P1和3CD蛋白可以在釀酒酵母中成功表達,蛋白酶3CD將P1蛋白切割成VP1、VP2、VP3和VP4,后者在