丙型肝炎病毒高變區(qū)1模擬表位的交叉反應(yīng)性與反應(yīng)頻率分析.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)為黃病毒科丙型肝炎病毒屬內(nèi)唯一成員，其基因組是單股正鏈RNA。HCV感染可導(dǎo)致慢性丙型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等，對人類健康造成嚴(yán)重危害。目前全球約有1.7億HCV感染者，其中我國約有4000萬。聯(lián)合應(yīng)用干擾素和利巴韋林是目前治療HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)方案，但治療費用高，副作用較大，且療效因HCV基因型別的不同而呈現(xiàn)明顯差異。當(dāng)前HCV疫苗研制尚未取得成功，篩選有效的抗原表位對于HCV疫

2、苗的研發(fā)至關(guān)重要。 位于病毒體表面的HCV包膜蛋白2(E2)區(qū)含有中和抗體表位，能誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性抗體。高變區(qū)1(hypervariable region 1，HVRl)位于E2的N端，由27個氨基酸殘基組成，序列高度變異，HVR1誘生的抗體無論在體外還是在黑猩猩的實驗中均可以阻斷HCV的感染。曾認(rèn)為HVR1的變異使得抗體缺乏普遍保護性，然而最近的研究結(jié)果顯示，一些不同氨基酸序列的HVR1具有明顯的交叉抗原性，誘生的抗體具有交叉反

3、應(yīng)性。這為基于HVR1或E2蛋白的HCV疫苗的研制帶來了希望。研究表明，用不同于天然HVR1氨基酸序列的合成肽免疫小鼠所誘導(dǎo)的抗體能與不同株HCV的HVR1發(fā)生交叉反應(yīng)，這類能模擬來源于不同株HVR1抗原性的表位(模擬表位)在HCV疫苗研究中的應(yīng)用前景值得探討。 一、HVR1融合蛋白在大腸桿菌中的表達、純化及與HCV陽性血清的反應(yīng)本研究分別從文獻資料中選取了HVR1的12條模擬表位，將其編碼序列與pET32a原核表達載體中的硫氧

4、還蛋白(Trx)基因融合后插入pET32a載體中，構(gòu)建的12種表達載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、酶切鑒定以及DNA測序證明擴增、拼接序列與預(yù)期完全一致。將12種重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達，菌體經(jīng)超聲破碎后進行鎳柱純化，得到了12種HVR1融合蛋白。此外，還表達、純化了空載體pET32a表達的硫氧還蛋白。 收集30份HCV抗體陽性血清，10份正常對照血清，ELISA檢測HVRl融合蛋白與血清

5、的反應(yīng)。各表位蛋白與10份健康人對照血清反應(yīng)的OD值均低于0.1。各表位蛋白與30份陽性血清中的大部分能發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)率分別為46.7％ (P1)、43.3％(P2)、66.7％(P3)、56.7％(P4)、70％(P5)、70％(P6)、53.3％(P7)、56.7％(P8)、70％(P9)、60％(PlO)、60％(P11)、53.3％(P12)。這12種表位蛋白聯(lián)合，可與30份血清中的29份發(fā)生陽性反應(yīng)，反應(yīng)率升至96.6

6、％。進一步分析發(fā)現(xiàn)，P5、P6、P7、P9四種表位蛋白也聯(lián)合可達到上述效果。其中P5、P6、P9均能與30份血清中的21份發(fā)生陽性反應(yīng)，較其他9種表位蛋白為高。 二、HVR1融合蛋白免疫小鼠及小鼠血清中的抗體檢測。 取上述HVRl融合蛋白以及空載體pET32a表達的硫氧還蛋白分別免疫BALB/c小鼠。融合蛋白與福氏完全佐劑乳化，背部皮下多點注射，200 μg/只；2周后，肽與不完全福氏佐劑乳化，以相同劑量免疫，1次/2周

7、，共2次。第8周取小鼠血清進行Western blotting和ELISA檢測。 Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，HVR1 融合蛋白免疫的 BALB/c鼠血清均可與相應(yīng)的表位蛋白發(fā)生反應(yīng)，表明血清中存在相應(yīng)的抗表位蛋白的抗體。 由于EIASA檢測證實P5與丙肝陽性血清的強陽性反應(yīng)率最高，所以我們合成了P5肽，ELISA方法分析P5肽與12種HVR1融合蛋白免疫BALB/c鼠血清的反應(yīng)。結(jié)果：合成P5肽與其他11

8、種HVR1融合蛋白免疫BALB/c鼠血清可發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)。與硫氧還蛋白免疫的鼠血清不發(fā)生反應(yīng)。 ELISA檢測HVR1融合蛋白免疫的BALB/c鼠血清與HVR1合成肽的反應(yīng)頻率。12種表位蛋白免疫的鼠血清均能與2條具有較大差異J4和H77株的HCVHVR1表位合成肽發(fā)生反應(yīng)?？蛰d體pET32a表達的硫氧還蛋白免疫BALB/c鼠血清并不與2條HVR1合成肽發(fā)生反應(yīng)。此結(jié)果提示，12種表位蛋白均可誘導(dǎo)出與HCV HVR1表位

9、合成肽具有高交叉頻率的中和抗體。 三、HCV假病毒中和試驗 將H77株pcDNA-HCVE1E2、pCMV-gag-pol、pCMV-GFP轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞包裝 HCVpp，將含HCVpp的上清感染人肝癌 Huh7.5細(xì)胞，感染52 h后，于熒光顯微鏡下觀察GFP熒光。 結(jié)果顯示，三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞上清感染的Huh7.5細(xì)胞有GFP綠色熒光的表達，表明HEK293T細(xì)胞上清中存在感染性的HCV

10、假病毒；含假病毒的上清與P5、P6融合蛋白免疫鼠血清共孵育后感染7.5細(xì)胞，則GFP熒光明顯減弱，熒光細(xì)胞數(shù)量減少。而含假病毒的上清與Trx免疫鼠血清共孵育后感染Hub7.5細(xì)胞，GFP熒光不受影響，表明HVR1融合蛋白免疫的鼠血清能中和HCVpp的感染性。 結(jié)論：實驗對12條HCV HVR1模擬表位進行研究，得到的表位蛋白能被多數(shù)HCV患者陽性血清特異識別，接種小鼠后能誘導(dǎo)出針對不同株HVR1的交叉反應(yīng)性抗體，能中和HCVpp