丙型肝炎病毒5’端非編碼區(qū)的不同結構域對其翻譯啟動活性的影響.pdf

1、目的丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的主要原因，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。HCV 5'端非編碼區(qū)(5'NCR)含內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，以非帽依賴機制介導著-HCV基因翻譯，且堿基序列高度保守，因此HCV 5'NCR是抗HCV藥物篩選的主要靶位點。本實驗旨在構建一系列含有HCV 5'NCR 5'端梯度缺失序列調控螢火蟲熒光素酶(luc)報告基因的真核表達質粒，以分析影響HCV 5'NCR的翻譯啟動活性的功

2、能序列，為進一步研究HCV IRES的結構與功能提供實驗和理論依據(jù)。 方法以pCMVNCRluc(以下簡稱pCNI)為模板，PCR 擴增獲得一系列HCV 5'NCR 5’端梯度缺失序列，然后利用基因重組技術，用這些序列分別替換pCNI中的完整HCV 5'NCR，構建HCV 5'NCR5，端梯度缺失序列調控luc的真核表達質粒pCNl-d1、pCNl-d2、pCNl-d3、pCNI-d4；同時。PCR擴增缺失所有HCV序列的模板

3、片段，構建無HCV 5'NCR片段的luc真核表達質粒pCNI-d5；各重組質粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定；用脂質體介導基因轉染技術，將上述重組質粒及pCNl轉染至人肝癌細胞株HepG2；轉染后48h用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶相對活性以分析5'NCR 5'端梯度缺失序列對luc基因的調控作用，并經(jīng)RT-PCR檢測轉染細胞中l(wèi)uc基因的相對表達水平觀察luc基因在轉錄水平有無不同。 結果PCR擴增分別獲得5'端缺失ntl

4、-20,ntl-43,ntl-118和ntl-330的HCV 5'NCR片段，及缺失所有HCV序列的模板片段；經(jīng)酶切和測序鑒定表明HCV 5'NCR 5'端梯度缺失序列調控luc的真核表達質粒pCNl-dl、pCNl-d2、pCNI-d3、pCNl-d4和無HCV 5'NCR片段的luc真核表達質粒pCNl-d5構建成功；各重組質粒轉染細胞后luc mRNA的相對表達水平與pCNl相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)：pCNl-d1、p

5、CNl-d2表達的熒光素酶活性與pCNl差異無顯著性(P>0.05)，pCNl-d3與pCNl-d4的熒光素酶活性與空白對照差異無顯著性(P>0.05)，pCNl-d5的熒光素酶相對表達活性為pCNl的70％。 結論 成功構建了由HCV 5'NCR 5’端梯度缺失序列調控luc表達的質粒pCNl-dl、pCNl-d2、pCNl-d3、pCNl-d4和無HCV 5'NCR片段的luc真核表達質粒pCNl-d5；在本實驗條件下，HC