黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)域突變對其活性影響的研究.pdf

1、黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger lipase，ANL）是一類廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品添加劑和洗滌劑添加劑等工業(yè)領(lǐng)域，具有良好生物安全性的生物催化劑。本論文以本課題組保藏的、分離自新疆火山口的脂肪酶高產(chǎn)菌株黑曲霉FJNU01菌株為出發(fā)材料，克隆其脂肪酶基因。通過比較黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)及其兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列與黑曲霉阿魏酸酯酶（A.niger feruloyl esterase，ANE）對應(yīng)區(qū)域的氨基酸殘基序列的差

2、異，確定突變位點(diǎn)，構(gòu)建了一系列脂肪酶突變體。
　　 利用重疊延伸PCR方法，對黑曲霉脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)兩側(cè)鉸鏈區(qū)上的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了anl-S84G、anl-D99P、anl-K108E三個(gè)突變脂肪酶基因；將組成脂肪酶整個(gè)α-螺旋蓋子結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基序列替換成阿魏酸酯酶對應(yīng)結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基序列，獲得了脂肪酶突變基因anl-anelid；將組成脂肪酶蓋子結(jié)構(gòu)左右兩側(cè)鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列替換成阿魏酸酯酶對應(yīng)區(qū)域的氨基酸

3、殘基序列，獲得了脂肪酶突變基因anl-lidLR。
　　 將分子改造后的脂肪酶突變基因插入到pPIC9K質(zhì)粒中，構(gòu)建系列重組表達(dá)載體；重組表達(dá)載體經(jīng)SacⅠ線性化后導(dǎo)入到巴斯德畢赤酵母GS115，篩選得到重組轉(zhuǎn)化子。重組轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集發(fā)酵上清液，然后用堿性滴定法測定重組脂肪酶突變體酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：GS-pPIC9K-anl-D99P和GS-pPIC9K-anl-K108E重組子發(fā)酵上清液的脂肪酶酶活分別為21

4、.37U/mL和16.30U/mL，相對野生型脂肪酶分別為85.48％和65.20％，而GS-pPIC9K-anl-S84G、GS-pPIC9K-anl-anelid和GS-pPIC9K-anl-lidLR的發(fā)酵上清液均未檢測到脂肪酶活性。用Ni-NTA純化上述發(fā)酵上清液中的重組蛋白，純化后的蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：ANL-S84G、ANL-D99P、ANL-K108E、ANL-anelid均顯示單一條帶，而anl-lidL