原卟啉原Ⅸ氧化酶及其機(jī)制的計(jì)算化學(xué)研究.pdf

1、原卟啉原Ⅸ氧化酶(PPO)催化氧化原卟啉原Ⅸ成為原卟啉Ⅸ，廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中，是生物體內(nèi)葉綠素和亞鐵血紅素合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。
　　在人體中，PPO的缺損會(huì)造成顯性遺傳疾病混合型卟啉癥(VariegatedPorphyria，VP)。目前，VP患者的數(shù)量和發(fā)病地域在不斷擴(kuò)大。同時(shí)，PPO也被利用于光動(dòng)力學(xué)對(duì)于癌癥的治療，因此對(duì)PPO的研究具有重要的醫(yī)學(xué)意義。植物體內(nèi)的PPO的活性被抑制劑所抑制會(huì)導(dǎo)致綠色植物組織

2、的干枯與白化，最終使得植物死亡，因而PPO是一大類除草劑的作用靶標(biāo)。因PPO非植物所特有，考慮到人畜及環(huán)境安全，種屬選擇性是針對(duì)該靶標(biāo)設(shè)計(jì)、開發(fā)除草劑的關(guān)鍵問題。而且，開發(fā)抗PPO抑制劑除草劑的轉(zhuǎn)基因作物，能夠減少農(nóng)藥的使用，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此對(duì)PPO的研究具有重要農(nóng)學(xué)意義。另外，PPO是植物光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要因子;PPO的多底物特性、催化底物的電子轉(zhuǎn)移功能，也使得底物的結(jié)合與催化機(jī)制的研究非常具有研究?jī)r(jià)值。

3、
　　鑒于PPO在生物體內(nèi)的重要性，以及在醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)上的應(yīng)用，本文選擇了PPO作為主要的研究對(duì)象。在本論文中我們主要進(jìn)行了以下五方面的工作:
　　一、多種屬的PPO生物信息學(xué)研究。通過對(duì)小同種屬的PPO的序列和結(jié)構(gòu)的比較，識(shí)別了PPO活性位點(diǎn)保守殘基和差異殘基，揭示導(dǎo)致不同種屬PPO在細(xì)胞內(nèi)的定位方式與聚集狀態(tài)差異的序列因素和結(jié)構(gòu)因素，從原子水平上認(rèn)識(shí)了不同種屬對(duì)抑制劑選擇性及天然抗性的序列因素和結(jié)構(gòu)因素，為選擇性抑制劑的設(shè)

4、計(jì)提供最直接的信息。
　　二、PPO與底物相互作用的研究。運(yùn)用計(jì)算化學(xué)中分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，系統(tǒng)研究了底物在三個(gè)種屬PPO（煙草線粒體、枯草芽孢桿菌和人體）中的結(jié)合方式，為PPO催化機(jī)制的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)提供了指導(dǎo)。
　　三、PPO功能的計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究。結(jié)合定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和分子動(dòng)力學(xué)模擬，識(shí)別出人體PPO和枯草芽孢桿菌PPO中，對(duì)于PPO活性的保持有重要作用的極性作

5、用網(wǎng)絡(luò)。發(fā)現(xiàn)這個(gè)極性作用網(wǎng)絡(luò)通過穩(wěn)定FAD的異咯嗪環(huán)的結(jié)合環(huán)境，進(jìn)而穩(wěn)定底物與FAD之間的相互作用以維持酶的催化活性。另外，還對(duì)人體PPO活性空腔的殘基功能進(jìn)行定義，闡述了這些殘基對(duì)于底物與PPO的結(jié)合的貢獻(xiàn)。這些結(jié)果為進(jìn)一步改造PPO，利用PPO發(fā)展抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物提供了關(guān)鍵信息。
　　四、卟啉癥分子致病機(jī)制的研究。結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，闡釋了PPO致病突變體酶功能的喪失與平衡態(tài)構(gòu)象的關(guān)系，通過引入定量描述PPO平衡

6、態(tài)構(gòu)象的參數(shù)——優(yōu)勢(shì)構(gòu)象概率，建立了預(yù)測(cè)PPO催化活性的方法（Prezyme），并準(zhǔn)確預(yù)測(cè)了44個(gè)卟啉癥突變體的催化活性，闡述了其分子致病機(jī)制。該方法也對(duì)不同種屬PPO的催化活性有較好的預(yù)測(cè)。
　　五、PPO與抑制劑相互作用的研究。我們獲取了人體PPO與兩個(gè)二苯醚類抑制劑除草劑，乙氧氟草醚和氟磺胺草醚復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，其分辨率分別為2.3(A)和2.0(A)。針對(duì)抑制劑三氟羧草醚對(duì)于煙草線粒體PPO、人體PPO和枯草芽孢桿菌PPO

7、抑制活性的差異進(jìn)行了計(jì)算研究。我們發(fā)現(xiàn)，煙草PPO中的Phe392、Leu372、Leu356、Phe353和Arg98等殘基是抑制劑結(jié)合的重要位點(diǎn)，人體PPO在Phe392和Leu372殘基上相對(duì)于煙草PPO的差異是使得抑制劑對(duì)人體PPO的抑制活性較差的主要因素;而枯草芽孢桿菌PPO在上述位點(diǎn)的殘基性質(zhì)相對(duì)于煙草PPO表現(xiàn)除了較大的差異，使得抑制劑不能結(jié)合到上述位點(diǎn)，從而產(chǎn)生抑制劑的抗性。計(jì)算模擬的結(jié)果得到了定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)很好的驗(yàn)證。<

8、br>　　綜上所述，本文結(jié)合生物化學(xué)和計(jì)算化學(xué)方法，對(duì)于PPO的分子機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究。識(shí)別不同種屬PPO序列和結(jié)構(gòu)上的差異之處，為種屬間PPO性質(zhì)的研究和定點(diǎn)突變體實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)。獲得了不同種屬PPO與底物的結(jié)合模型，為PPO催化機(jī)理的研究和抑制劑的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)和信息。結(jié)合定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)和計(jì)算模擬方法，對(duì)PPO突變體進(jìn)行了研究，為理解PPO結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供了指導(dǎo)。發(fā)展了一套能夠定量預(yù)測(cè)卟啉癥相關(guān)PPO突變體的方法，闡述了卟啉癥突