子宮內膜癌雌激素依賴型與非依賴型基因表達譜的初步研究.pdf

1、在美國，子宮內膜癌(endometrialcarcinoma)是一種最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在所有的腫瘤中排名第四，僅次于乳腺癌、肺癌和大腸癌。2000年，美國大約新增36,100新病例，約有6,500死于這種疾病。我國子宮內膜癌也已成為女性最常見的惡性腫瘤之一。 一般認為，子宮內膜癌的發(fā)生與雌激素長期刺激有直接關系，是一種雌激素依賴性腫瘤，其發(fā)現(xiàn)較早，預后較好，5年生存率達70％左右。但在實際臨床工作中發(fā)現(xiàn)：部分患者，尤

2、其是絕經后患者，并無內源性或外源性高雌激素的表現(xiàn)，而且激素治療效果不好，預后較差。 本研究應用美國Affymetrix公司制備的HumanGenomeU133Plus2.0原位合成寡核苷酸芯片(該基因芯片一共有54,614個探針組，分析47,000個轉錄本和變異體，其中包括了可能的38,500個已知基因)對子宮內膜癌Ⅰ型(實驗組)和Ⅱ型(對照組)樣品各3例配對進行了檢測，希望能初步探討兩種亞型相應的分子生物學標志，進而為子宮內膜

3、癌的診斷、治療和評估預后提供分子依據。 6例標本總RNA被提取純化后，mRNA反轉錄合成cDNA，然后體外轉錄合成cRNA并用生物素標記，與寡核苷酸芯片進行雜交反應。芯片圖像掃描后經軟件處理，雜交信號以數(shù)據的形式輸出。掃描后的原始數(shù)據進一步經標準化處理后得到標準化的各探針組的“報告信號值”。由于每個探針組由11-20個PM-MM探針對組成，如果要判定檢測樣品中基因的是否表達，需對探針組各PM-MM探針表達信號值行符號秩和檢驗(O

4、ne-sidedWilcoxon'sSignedRanktest)。當探針組各PM-MM探針對表達信號檢驗P值＜0.04時，判定該基因或EST在樣品中表達(PresentP)；當P值＞0.06時，判定該基因或EST在樣品中不表達(AbsentA)。該基因或EST介于表達與不表達之間時以(marginalM)代表。利用統(tǒng)計學方法比較子宮內膜癌Ⅰ型和Ⅱ型兩種樣品之間探針雜交熒光強度比值，建立兩者之間的基因差異表達譜。 根據Affym

5、etrix基因芯片數(shù)據篩選標準，發(fā)現(xiàn)所有上調基因和EST序列為2,971個，其中差異倍數(shù)在一倍以上的有888，二倍以上的有222個；下調基因和EST為3,812，其中差異倍數(shù)在一倍以上的有2,301個，二倍以上的有742個。 隨后，基因芯片結果半定量RT-PCR驗證。6個基因被隨機選擇，其中CXCL5、LY6D和LEFTY1在子宮內膜癌Ⅰ型中高表達，而IFNG、FGF1和ORM2子宮內膜癌Ⅱ型中高表達。結果顯示，基本上所有的RT

6、-PCR檢測表現(xiàn)出與芯片結果一致的變化趨勢，表明了芯片結果的可重復性。 1.上調基因 1.1雌激素代謝和轉化基因： CYP2C9編碼了細胞色素P450超家族酶成員中的一員。細胞色素P450超家族為單加氧酶，能催化多種反應，涉及代謝、合成膽固醇、類固醇和其它脂質。CYP2C9定位在內質網上，其表達受rifampin誘導。該酶是眾所周知的代謝phenytoin，tolbutamide，ibuprofen和S-warf

7、arin。研究鑒定有些個體在代謝phenytoin和tolbutamide能力很差，暗示該基因多態(tài)性。Modugno等利用半定量RT-PCR分析29對乳腺癌及臨近非癌組織¨CYPs(CYP1A1，CYP1A2，CYPB1，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C18，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4，andCYP3A5)mRNA表達發(fā)現(xiàn)，僅僅只有四個CYPs(CYP1A1，CYPB1，CYP2C9，CYP3A4)在

8、乳腺癌及臨近非癌組織能檢測到表達。其中CYP1A1，CYPB1，CYP3A4涉及了雌二醇羥基化作用，CYP2C9參與了雌酮硫酸鹽轉化為16-羥基硫酸鹽代謝。CYP2C9高表達是由于雌激素的高表達誘導所至，參與了雌激素的代謝。 脫氫表雄酮硫酸轉移酶(dehydroepiandrosteronesulfotransferaseDST)基因編碼黏附連接板蛋白plakin蛋白家族成員之一參與了類固醇激素硫酸化。許多類固醇激素硫酸化被發(fā)現(xiàn)

9、發(fā)生在胎兒和成人的幾處組織里。脫氫表雄酮硫酸鹽在發(fā)育中的胎兒中產量很高，認為主要是人在懷孕狀態(tài)下高雌激素的緣故。Ⅰ型子宮內膜癌由于處于高雌激素刺激狀態(tài)，因此，DST表達也由于雌激素的原因而高表達，由此也認為，該基因也會隨著雌激素含量的降低而表達下調。DST基因或許可以作為Ⅰ型子宮內膜癌的標志物和治療反應預后標志物之一。 1.2雌激素調節(jié)基因 CFTR(cysticfibrosistransmembraneconducta

10、nceregulator)，又稱為ABCC7，是ABC轉運子超家族中MRP亞家族中成員之一，涉及了多藥耐藥。該蛋白是一種cAMP激活的氯離子通道，控制其它轉運通路的調節(jié)。這種基因突變在常染色體隱性疾病囊腫性纖維化和先天性雙側輸精管萎縮癥已經被發(fā)現(xiàn)。Rochwerger等首次報道了在活體內小鼠子宮上皮中，CFTR表達調節(jié)是依賴于雌激素。隨后他們在體外，通過新建的子宮上皮細胞系證實，CFTR的表達由雌激素控制。Tsang發(fā)現(xiàn)，在無酚紅的培養(yǎng)

11、基中，forskolin-stimulatedI(SC)表達明顯下調，進一步在charcoal/dextran處理的fetalbovineserum(FBS)中，此時類固醇激素已經被除掉，SC含量繼續(xù)降低。而forskolin-stimulatedI表達上調是由CFTR介導，這暗示了酚紅和類固醇激素可以上調CFTR的表達。CFTR在女性生殖管道中表達，但其在子宮中的功能一直不是很清楚。Rowlands等利用RT-PCR方法，通過在卵巢切

12、除的小鼠比較17beta雌二醇(17beta-oestradiol)和BakFoongPill(BFP)治療后CFTR在子宮中的表達水平來研究其生理作用。結果發(fā)現(xiàn)，17beta雌二醇和BakFoongPill都能上調CFTRmRNA的表達。該結果暗示CFTR可以被雌激素誘導表達上調，顯示了CFTR可能在生殖功能中起了重要作用。子宮內膜癌Ⅰ型是雌激素依賴型的惡性腫瘤，雌激素的持續(xù)刺激是導致腫瘤發(fā)生的主要原因。CFTR在子宮內膜癌Ⅰ型中高表

13、達，反過來暗示了這型病人有雌激素的高表達。因此，CFTR或許可以作為該型的生物學標志物之一，區(qū)分Ⅱ型子宮內膜癌。 Wafa利用酵母雙雜交技術發(fā)現(xiàn)，DDC(L-dopadecarboxylase)能與AR(androgenreceptor)相互作用(AR是配體調節(jié)轉錄因子，屬于類固醇受體家族，在前列腺的生長和發(fā)育上發(fā)揮了關鍵的作用)，增強類固醇受體的轉錄活性，或許與前列腺癌的發(fā)生有關。該基因表達在子宮內膜癌Ⅰ型中表達，或許也是通過

14、類似作用，參與了雌激素(類固醇激素)依賴的子宮內膜癌的發(fā)生。 SOCS-3是細胞信號蛋白家族抑制子，負性調節(jié)細胞因子作用。Matthews等研究雌激素(E2)對T47D和MCF-7人乳腺癌細胞系中SOCS-3表達影響發(fā)現(xiàn)，ERalpha能直接調節(jié)人乳腺癌細胞中人SOCS-3啟動子的活性，因此調節(jié)細胞因子的活性。Leong等發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人肝細胞中，雌激素能以時間和劑量依賴的方式增加SOCS-3的表達。用雌激素長期處理野生型和ER

15、beta基因敲除小鼠中(3week)發(fā)現(xiàn)，肝臟SOCS-3被誘導表達升高2-3倍，而ERalpha基因敲除小鼠卻無SOCS-3表達上調。這暗示了雌激素通過ERalpha上調肝細胞SOCS-3的表達。該基因在子宮內膜癌Ⅰ型中高表達，主要也是由于雌激素誘導所致，可能參與腫瘤的發(fā)病過程。 2.下調基因 Fos基因家族包括四個家族成員：FOS，F(xiàn)OSB，F(xiàn)OSL1和FOSL2。這些基因編碼亮氨酸拉鏈，能與JUN蛋白家族二聚體化，

16、形成轉錄因子復合物AP-1。FOS蛋白家族已經牽涉到細胞的增殖、分化和轉化等。子宮內膜癌Ⅱ型相對Ⅰ型更加惡劣，預后較差。FOSB在Ⅱ型子宮內膜癌中相對高表達，支持該型腫瘤惡性程度較高。 NTRK2編碼神經酪氨酸受體激酶家族成員之一。這種激酶是一種膜結合受體，能磷酸化自身以及MAPK通路成員，信號通過該激酶導致細胞增殖。該基因在Ⅱ子宮內膜癌中高表達，可能參與了腫瘤細胞的增殖。JUN是一種癌基因，這種基因為推測性的鳥類肉瘤病毒17的

17、轉化基因。它編碼一種與病毒蛋白高度相似的基因，能直接與特異的靶DNA序列相互作用。Yokoyama等報道那些c-jun陽性病人與c-jun陰性病人相比較，預后更差。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，c-jun的表達與淋巴結轉移呈正相關，因此認為c-jun能促進子宮內膜癌轉移。Salmi在研究惡性子宮內膜與正常周期的子宮內膜時發(fā)現(xiàn)，c-jun和ER的表達相關性已經丟失。Li等發(fā)現(xiàn)，在絕經期后的子宮內膜癌患者，相對于正常對照、絕經后子宮出血和萎縮的子宮內膜