子宮內(nèi)膜樣癌中microRNA-21的表達及其對PTEN基因調(diào)控的初步研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜樣癌中microRNA-21的表達及其對PTEN基因調(diào)控的初步研究
　　 子宮內(nèi)膜癌是婦女最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，按照病理組織學(xué)特點可分為子宮內(nèi)膜樣癌(I型)和非子宮內(nèi)膜樣癌(II型)，其中，80-90％的病例屬于子宮內(nèi)膜樣癌。子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于圍絕經(jīng)期婦女，合并肥胖、糖尿病、高血壓、未曾生育者以及長期不排卵者皆是高危險族群，其中超過86％的病人年齡在50歲以上。隨著高血壓、冠心病、肥胖、糖尿病和代謝綜合征等高危因素

2、疾病發(fā)病率的提高以及人們飲食結(jié)構(gòu)的漸行改變，該病發(fā)病率逐年增高且發(fā)病年齡年輕化。但子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的分子機制尚不清楚。早期發(fā)現(xiàn)和治療是改善預(yù)后、提高治愈率的關(guān)鍵。深入研究子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因的異常表達機制將有助于其早期診斷、預(yù)防及治療，具有極其重要的意義。
　　 PTEN基因(phosphataseandtensinhomologuedeletedfromchromosome10)位于10q23.3，是重要的抑癌基因，PTEN蛋白的

3、缺失(又稱為功能性失活)與子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，小鼠純合型PTEN基因的失活可直接并迅速地導(dǎo)致子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病。目前認(rèn)為PTEN抑癌作用主要與其蛋白酪氨酸磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶的活性有關(guān)。研究顯示，已知PTEN在PI3-K/Akt/PKB/cyclinD,GSK3β/βcatenin/cyclinD,FAK/MAPK,PI3-K/Akt/mTOR/STAT3等通路中起重要抑制作用，能夠促凋亡、抗增殖，而其缺失或突變則導(dǎo)致腫瘤的

4、發(fā)生。然而，子宮內(nèi)膜樣癌中PTEN蛋白失活的機制尚不明確。據(jù)報道，子宮內(nèi)膜樣癌中PTEN蛋白的失活率為50-83％，而其PTEN基因的突變率僅為34-55％，單純用突變機制不足以解釋子宮內(nèi)膜樣癌中PTEN蛋白的失活。近年來，一種新的基因調(diào)控因子microRNAs的發(fā)現(xiàn)，為深入研究基因的調(diào)控及疾病的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路。本論文試圖從新的角度——microRNA方面探討子宮內(nèi)膜樣癌中PTEN基因的調(diào)控機制。
　　 MicroRNA

5、s是指18到25個核苷酸大小的非編碼RNA分子，通過結(jié)合與之互補或部分互補的編碼蛋白質(zhì)的mRNA起到調(diào)節(jié)其表達的作用，包括抑制其轉(zhuǎn)錄或降解。這是一種新近發(fā)現(xiàn)的新層次的基因表達調(diào)控機制。MicroRNA就像是“分子變阻器”，精調(diào)著每個基因的蛋白合成。MicroRNAs在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種作用，能夠與靶mRNAs3'端非編碼區(qū)域(3'-UTR)相結(jié)合，使靶基因mRNA降解或沉默從而阻止其進一步的翻譯表達。目前，MicroRNAs被認(rèn)

6、為是可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的因子。MicroRNAs作為一種可調(diào)控基因表達的內(nèi)源性小分子，是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，典型的microRNAs是靶向多個基因而不是單個基因，在體內(nèi)形成重要的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞惡性生物學(xué)行為改變。
　　 MicroRNA-21(miR-21)作為最早被發(fā)現(xiàn)的microRNAs分子之一，已經(jīng)被證實在多種腫瘤組織中異常表達(多為實體腫瘤)，如結(jié)腸直腸癌、膽管癌、淋巴瘤、多發(fā)性

7、骨髓瘤、頭頸部癌、腦膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮肌瘤等。MiR-21的異常表達可以影響腫瘤的增殖、凋亡、血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。MengF等在人肝癌細(xì)胞中的研究表明，miR-21可以通過調(diào)節(jié)PTEN表達起到促進癌細(xì)胞增殖、遷移、浸潤的作用，PTEN是miR-21的直接靶基因之一。
　　 迄今為止，尚無有關(guān)miR-21在子宮內(nèi)膜癌中表達的研究報道。據(jù)有關(guān)研究顯示，在子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中差異表

8、達的miRNAs分子中包括hsa-miR-21，并且證明了miRNAs的異常表達受雌孕激素的影響，其通過作用于靶基因，在正常子宮內(nèi)膜活性和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中起核心性作用。這說明miR-21在子宮內(nèi)膜中亦有表達，而且其靶基因在內(nèi)膜細(xì)胞活性和病理生理方面起重要的作用。本研究旨在揭示子宮內(nèi)膜樣癌中miR-21的表達情況，研究其對PTEN基因的調(diào)控機制及對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　 第一部分
　　 MicroRNA-

9、21在子宮內(nèi)膜樣癌中的表達及其與PTEN表達的相關(guān)性
　　 研究目的
　　 1.檢測并分析miR-21在子宮內(nèi)膜樣癌癌灶與相應(yīng)癌旁組織中是否存在差異表達。
　　 2.分析miR-21的表達與子宮內(nèi)膜樣癌組織的臨床病理特征如臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及肌層浸潤之間的關(guān)系。
　　 3.檢測子宮內(nèi)膜樣癌組織中PTEN蛋白水平的表達，并分析其與miR-21的表達是否具有相關(guān)性。
　　 研究方法

10、>　　 1.收集新鮮未經(jīng)任何干預(yù)治療的子宮內(nèi)膜樣癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。
　　 2.應(yīng)用莖環(huán)引物實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-PCR)反應(yīng)的方法檢測子宮內(nèi)膜樣癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中miR-21的表達。
　　 3.采用蛋白免疫印記(WesternBlot)方法，檢測PTEN蛋白在子宮內(nèi)膜樣癌癌灶及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中的表達。
　　 結(jié)果
　　 1.MiR-21在所檢測子宮內(nèi)膜樣癌癌灶及相應(yīng)癌旁組織

11、中均有表達，其在腫瘤組織中的表達約為癌旁組織的2.879倍(范圍1.021-7.402，標(biāo)準(zhǔn)差為1.625，P＜0.05)。
　　 2.MiR-21在各臨床分期的子宮內(nèi)膜樣癌腫瘤組織中相對表達量分別為:Ⅰ期2.178±1.158，Ⅱ、Ⅲ期3.510±1.749，miR-21在Ⅱ+Ⅲ期較Ⅰ期內(nèi)膜樣腺癌組織中相對表達量明顯升高(P=0.01);miR-21在肌層浸潤深度大于1/2肌層組中腫瘤組織的相對表達量為3.972±1.797，

12、明顯高于其在肌層浸潤深度小于1/2肌層組的相對表達量2.084±0.881(P=0.001);miR-21在G1、G2及G3期子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中的相對表達量分別為:1.376±0.229，2.452±0.447及5.002±1.299，G3較G2及G2較G1期內(nèi)膜樣腺癌腫瘤組織中miR-21相對表達量均明顯升高(P＜0.01)。
　　 3.WesternBlot分析結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜樣癌組織PTEN蛋白的相對表達量明顯低于相應(yīng)

13、癌旁組織(P＜0.05)。
　　 4.Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜樣癌腫瘤組織中miR-21的相對表達量與PTEN蛋白的相對表達量顯著負(fù)相關(guān)(Pearsoncorrelation=-0.762，P＜0.001)。
　　 結(jié)論
　　 MiR-21在子宮內(nèi)膜樣癌腫瘤組織較相應(yīng)癌旁組織表達增高，其相對表達量與腫瘤組織的臨床分期、病理分級及肌層浸潤深度呈正相關(guān)，提示miR-21可能在子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)生發(fā)展過程

14、中發(fā)揮重要作用。在子宮內(nèi)膜樣癌腫瘤組織中，PTEN蛋白與miR-21的表達呈負(fù)相關(guān)，提示兩者可能共同參與了子宮內(nèi)膜樣癌的發(fā)病。
　　 第二部分
　　 調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜樣癌KLE細(xì)胞中MicroRNA-21表達對PTEN及生物學(xué)行為影響的研究
　　 研究目的
　　 1.體外實驗在子宮內(nèi)膜樣癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-21模擬物、miR-21抑制物的寡聚核苷酸，構(gòu)建miR-21過表達和低表達模型。
　　 2.體

15、外實驗研究子宮內(nèi)膜樣癌細(xì)胞系中不同表達水平的miR-21對PTEN表達的影響。
　　 3.探討miR-21異常表達對子宮內(nèi)膜樣癌細(xì)胞增殖、遷移及浸潤等生物學(xué)行為的影響。
　　 研究方法
　　 1.用化學(xué)合成方法分別合成以miR-21成熟核苷酸序列為模板的miR-21模擬物(miR-21mimic)，反義的miR-21抑制物(miR-21inhibitor)以及各自對應(yīng)的陰性對照序列(ScrambledContro

16、l，SC)。通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別將miR-21模擬物、miR-21抑制物及各自對應(yīng)的陰性對照序列轉(zhuǎn)染入子宮
　　 2.應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后KLE中miR-21表達量的變化，進而運用WesternBlot及實時熒光定量PCR方法檢測不同miR-21水平對PTEN蛋白和mRNA基因表達產(chǎn)生的影響。
　　 3.用CCK-8試劑盒、劃痕實驗及侵襲實驗分別檢測不同水平miR-21對KLE

17、細(xì)胞增殖、遷移及浸潤功能的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.MiR-21模擬物、miR-21抑制物及各自對應(yīng)陰性對照序列均成功轉(zhuǎn)染入KLE細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率約90％。
　　 2.轉(zhuǎn)染后，與空白對照組相比，miR-21模擬物轉(zhuǎn)染組中miR-21的表達增加了6.898±0.312倍(P=0.003)，PTEN蛋白表達降低了53.8±2.7％(P=0.007)，細(xì)胞生長速度、遷移速度及浸潤能力均有明顯增加(P＜0.05);相

18、反，miR-21抑制物的轉(zhuǎn)染使miR-21表達降低了33.4±5.4％(P=0.007)，PTEN蛋白表達增加了1.888±0.147倍(P=0.002)，并顯著抑制了細(xì)胞的增殖、遷移及浸潤能力(P＜0.05);但是，兩組中的PTENmRNA的表達與空白對照組相比，均沒有明顯變化(P＞0.05)。
　　 結(jié)論
　　 MiR-21的過表達可顯著降低PTEN蛋白的表達并促進KLE細(xì)胞的增殖、遷移及浸潤，而miR-21的表達減