子宮內(nèi)膜癌中差異表達microRNA的篩選及miR-944對子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為影響的實驗研究.pdf

1、本課題旨在闡明子宮內(nèi)膜癌組織中的miRNA表達譜及miR-944對子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為影響及調(diào)控作用的機制研究。
　　研究內(nèi)容包括以下四部分:
　　第一部分 子宮內(nèi)膜癌組織中差異表達miRNA的篩選研究
　　目的:篩選出子宮內(nèi)膜癌組織中的差異表達的miRNA分子，獲得子宮內(nèi)膜癌miRNA表達譜，尋找新的診斷標(biāo)志物。
　　方法:收集3例子宮內(nèi)膜癌患者的癌變內(nèi)膜組織和3例正常對照組子宮內(nèi)膜組織，提取RNA，應(yīng)用丹麥E

2、xiqon公司的miRCURYTM LNA miRNA芯片，篩選出子宮內(nèi)膜癌組織中的差異表達的miRNA分子，采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)在樣本中進行驗證。
　　結(jié)果:1.3例癌組織和3例正常內(nèi)膜組織的總RNA抽取及質(zhì)檢，結(jié)果顯示，所提取的總RNA的電泳可見帶28s和18s條帶，260/A280的值都介于1.8-2.1之間，檢測RNA檢測結(jié)果符合雜交芯片實驗要求。
　　2.miRNA芯片結(jié)果顯示:子宮內(nèi)膜

3、癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織存在有顯著差異表達的miRNA:有14個miRNA表達上調(diào)，6個miRNA表達下調(diào)。
　　3.采用qRT-PCR方法對上調(diào)的miR-944、miR-373及下調(diào)的miR-548、miR-885進行驗證，結(jié)果顯示:子宮內(nèi)膜癌中miR-944、miR-373上調(diào)的倍數(shù)為3.13倍和4.2倍，miR-548、miR-885下調(diào)倍數(shù)為2.08倍及3.84倍，與芯片結(jié)果比較，趨勢一致。
　　結(jié)論：miRNA表達

4、譜芯片可用于分析子宮內(nèi)膜癌組織miRNA表達譜;通過miRCURYTMLNA miRNA芯片篩選結(jié)合qRT-PCR驗證，共得到14個顯著上調(diào)6個顯著下調(diào)的miRNA，為下一步開展子宮內(nèi)膜癌組織miRNA的研究及功能學(xué)研究提供實驗基礎(chǔ)。
　　第二部分 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-944表達及其與臨床病理特征的關(guān)系
　　目的:探討miR-944在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法:收集2012年3

5、月-2014年4月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者的癌變內(nèi)膜組織40例，收集同期因子宮肌瘤等良性病變行子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜組織25例作為對照。采用qRT-PCR方法進行miR-944表達水平的相對定量檢測，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。
　　結(jié)果:1.miR-944在子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達子宮內(nèi)膜癌組miR-944的表達水平高于及正常內(nèi)膜組（P＜0.05）。
　　2.miR-9

6、44與臨床病理特征的關(guān)系
　　miRNA-944的表達與組織學(xué)分級、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度及FIGO分期因素相關(guān)，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與年齡無相關(guān)性。
　　結(jié)論:miR-944在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達，提示miR-944可能參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展;miR-944的表達與組織學(xué)分級、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度及FIGO分期因素相關(guān)，可能可以預(yù)測子宮內(nèi)膜癌的惡性程度及不良預(yù)后。
　　第三部分

7、miR-944對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:探討miR-944對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和KLE細胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:人工合成miR-944的模擬物mimics及抑制物inhibitor，利用陽離子脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞和KLE細胞中。設(shè)置陰性對照組及空白對照組。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法對比轉(zhuǎn)染前后細胞增殖生長能力的區(qū)別;流式細胞

8、學(xué)對比轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡情況的區(qū)別;Transwell小室法對比轉(zhuǎn)染前后細胞遷移和侵襲能力的區(qū)別。
　　結(jié)果:1.細胞轉(zhuǎn)染效果
　　熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的miR-944 mimics的轉(zhuǎn)染效率，通過熒光鏡下視野與光鏡下視野對比，Ishikawa細胞和KEL細胞的轉(zhuǎn)染效率大約為85％。
　　2.miR-944-mimics及miR-944-inhibitor對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞KLE細胞生物學(xué)行為的影響。<

9、br>　　(1)CCK8法檢測細胞增殖實驗
　　分別在(24h、48h、72h、96h)四個時間點行CCK8檢測Ishikawa和KLE細胞的OD值，結(jié)果顯示，相對于對照組細胞，轉(zhuǎn)染了miR-944mimics的Ishikawa細胞和KLE細胞增殖活性均增強，轉(zhuǎn)染了miR-944inhibitor的 Ishikawa細胞和KLE細胞增殖活性均降低(P＜0.05)。
　　(2)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
　　對miR-944

10、轉(zhuǎn)染48h后的Ishikawa細胞進行流式細胞術(shù)細胞凋亡分析，結(jié)果顯示，B組、NC組、miR-944inhibitor組和miR-944mimics組凋亡率分別為0.58±0.06％、0.66±0.07％、11.74±0.19％、0.68±0.03％,miR-944inhibitor組凋亡率明顯高于B組(P＜0.05)，miR-944mimics組凋亡率與B組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。對miR-944轉(zhuǎn)染48h后的KLE細胞進行

11、流式細胞術(shù)細胞凋亡分析，結(jié)果顯示，B組、NC組、miR-944 inhibitor組和miR-944mimics組凋亡率分別為2.55±0.23％、2.53±0.10％、5.13±0.14％、2.99±0.18％，miR-944inhibitor凋亡率明顯高于B組(P＜0.05)，miR-944mimics組凋亡率與B組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)細胞侵襲實驗
　　檢測轉(zhuǎn)染48h后各組KLE細胞遷移能力，對

12、穿膜細胞進行拍照和計數(shù)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-944 mimics的KLE細胞穿膜數(shù)量較B組明顯增多(P＜0.05);轉(zhuǎn)染miR-944 inhibitor的KLE細胞穿膜數(shù)量較B組明顯減少(P＜0.05)。Ishikawa細胞過膜后鋪展性不好，拍照后無法計數(shù)，CCK8方法檢測過膜細胞，結(jié)果顯示:相對于對照組細胞，轉(zhuǎn)染了miR-944 mimics的Ishikawa細胞OD值高，間接反映了mimics組的穿膜數(shù)量多;轉(zhuǎn)染miR-944i

13、nhibitor的Ishikawa細胞OD低，間接反映了inhibitor組的穿膜數(shù)量少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:miR-944可促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，侵襲與轉(zhuǎn)移能力，降低miR-944水平可促進細胞凋亡，表明miR-944可能發(fā)揮癌基因的作用參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第四部分 miR-944對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學(xué)行為調(diào)控的靶基因預(yù)測及鑒定
　　目的:預(yù)測并實驗證實miR-944的靶基因，初步探討miR-

14、944的生物學(xué)機制。
　　方法:登陸microRNA庫及靶基因預(yù)測的網(wǎng)站，在線檢測或下載靶基因預(yù)測軟件，綜合運用TargetScan(http://genes.mit.edu/targetscan)、Mirbase（http://mirbase.org）、miRanda（http://www.microma.org）生物信息篩選miR-944最可能的靶基因。Westem blot(WB)對比轉(zhuǎn)染前后細胞表達靶基因的區(qū)別。構(gòu)建最可能

15、的靶基因的3' UTR雙熒光素酶報告載體，檢測熒光素的活性以期在基因水平上驗證靶基因上存在miR-944的作用靶點。
　　結(jié)果:1.預(yù)測miR-944的靶基因
　　通過預(yù)測軟件miRanda、Mirbase及TargetScan預(yù)測miR-944的靶基因，三個軟件交集的miRNA-944靶基因共70個;登陸基因庫，查詢以上靶基因功能，尤其注意與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的功能基因。最后選擇非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶14(prot

16、ein tyrosine phosphatase non-receptor type14，PTPN14)作為miR-944的可能靶基因來進一步研究。應(yīng)用Targetscan預(yù)測miR-944與PTPN14基因的結(jié)合位點。
　　2.蛋白水平驗證PTPN14是否為miR-944的靶基因
　　miR-944mimics組的KLE細胞的PTPN14蛋白表達量與B組比較下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); miR-944inhib

17、itor組則高于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）表明miR-944模擬物能降低KLE細胞中PTPN14蛋白的表達，B組與NC組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。在Ishikawa細胞中，miR-944mimics組，miR-944 inhibitor組的PTPN14蛋白表達量與B組均無差異(P＞0.05)。
　　3.miR-944與PTPN14的結(jié)合結(jié)合靶點驗證
　　將miR-944mimics與連接了PTPN14基因3'-UTR區(qū)的