KLK4在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)調(diào)控及生物學(xué)意義.pdf

1、目的：⑴檢測KLK4在正常子宮內(nèi)膜、增生性子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，探討其與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。⑵檢測KLK4在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL95-2，KLE中的表達(dá)，并以類固醇激素(雌激素、孕激素)和它莫昔芬處理細(xì)胞，探討類固醇激素對子宮內(nèi)膜癌中KLK4的調(diào)控。⑶探討在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中雌激素調(diào)控KLK4的信號通路。⑷探討KLK4對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制。 方法：①應(yīng)用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(realtime

2、RT-PCR)，和免疫組織化學(xué)方法檢測KLK4 mRNA和蛋白在正常子宮內(nèi)膜、增生性子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，并比較它們之間的表達(dá)差異及其在子宮內(nèi)膜癌臨床價值。②應(yīng)用real-time RT-PCR和Western blot方法檢測KLK4 mRNA和蛋白在RL95-2，KLE中的表達(dá)變化，觀察不同表型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中KLK4對不同藥物處理后的反應(yīng)。③對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2、KLE兩種不同ER狀態(tài)的細(xì)胞給予不同濃度的雌激素

3、(17-βE2)處理，采用real time RT-PCR及westernblot方法分別檢測兩種細(xì)胞中KLK4 mRNA的表達(dá)變化；western blot分析17-βE2處理后的兩種內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)MAPK/ERK1/2以及PI3K/Akt信號通路的變化，同時應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002和MAPK抑制劑U0126聯(lián)合17-βE2處理細(xì)胞后觀測兩種細(xì)胞中兩條信號通路與KLK4蛋白表達(dá)的相關(guān)性。④采用real time RT-PCR和

4、細(xì)胞免疫化學(xué)方法分別檢測兩種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系RL95-2和KLE細(xì)胞中KLK4的表達(dá)差異；采用RNA干擾技術(shù)，特異性敲除RL95-2中KLK4的表達(dá)，以流式細(xì)胞術(shù)分別檢測RNA干擾后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL95-2的細(xì)胞周期和凋亡變化并檢測KLK4敲除后細(xì)胞周期與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。 結(jié)果：⑴KLK4 mRNA在正常子宮內(nèi)膜、增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌組織中均有表達(dá)。KLK4 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著高于增生子宮內(nèi)膜

5、和正常子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)。⑵KLK4蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)水平顯著高于增生性子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜組織(P<0.01)。⑶KLK4蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)部位主要位于細(xì)胞核內(nèi)，KLK4與子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期無關(guān)(P=0.382)，但與組織分化程度相關(guān)(P<0.05)；在正常子宮內(nèi)膜組KLK4的表達(dá)強(qiáng)度雖無明顯差異(P=0.253)，但在增殖期內(nèi)膜中KLK4的表達(dá)有上調(diào)趨勢；KLK4表達(dá)強(qiáng)度與ER受體狀態(tài)無關(guān)(P=0

6、.594)。⑷real-time RT-PCR和western blot結(jié)果顯示，雌激素上調(diào)RL95-2和KLE細(xì)胞中KLK4的表達(dá)，以17-βE2濃度在10-10和10-8mol/L時上調(diào)作用最為明顯(P<0.01)，10-12mol/L濃度時上調(diào)作用與對照組無明顯差異(P>0.05)；MPA處理組顯示KLK4的下調(diào)表達(dá)，差異有顯著性(P<0.05)；TAM處理組KLK4的相對表達(dá)含量與對照組無顯著變化(P>0.05)。⑸兩種不同ER

7、受體狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中雌激素均不同程度的上調(diào)KLK4 mRNA的表達(dá)；雌激素能激活兩種細(xì)胞中PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2信號通路，雌激素對于KLK4的上調(diào)作用被MAPK/ERK1/2信號通路抑制劑U0126阻斷，而PI3K/Akt抑制劑不能阻斷雌激素對于KLK4的表達(dá)調(diào)控。⑹子宮宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL95-2中KLK4表達(dá)明顯強(qiáng)于KLE細(xì)胞。⑺以RL95-2細(xì)胞為平臺特異性對KLK4 mRNA干擾后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示RL9

8、5-細(xì)胞空白組、陰性對照組及干擾組處于S期的細(xì)胞比例分別為39.26±0.69％，39.20±0.79％，23.36±0.86％和17.78±0.35％，四組比較差異有顯著性(P<0.05)；細(xì)胞周期相關(guān)基因PCNA、cyclin D1和RB明顯下調(diào)，而cyclin E無明顯變化趨勢。⑻Annexin V和PI雙染細(xì)胞凋亡檢測顯示上述四組細(xì)胞處于早期凋亡的細(xì)胞比例分別為4.67±1.31％、4.30±1.2％、14.75±2.31％和2

9、2.28±2.48％，四組比較差異有顯著性(P<0.01)，細(xì)胞凋亡抑制相關(guān)基因Bcl-2明顯下調(diào)，而作為凋亡促進(jìn)基因的Bax表達(dá)上調(diào)，凋亡效應(yīng)子caspase3，8活化程度增強(qiáng)。 結(jié)論：①KLK4在子宮內(nèi)膜癌中過度表達(dá)，其定位于內(nèi)膜癌細(xì)胞核內(nèi)；表達(dá)強(qiáng)度與癌細(xì)胞的分化程度有關(guān)，與雌激素受體無關(guān)。提示KLK4對內(nèi)膜癌的發(fā)生及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程有較為重要價值。②雌、孕激素對于兩種不同ER狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中KLK4的表達(dá)有調(diào)控作用

10、，雌激素上調(diào)作用與細(xì)胞ER狀態(tài)無關(guān)，提示雌激素可能通過非經(jīng)典核內(nèi)受體調(diào)控模式影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。③雌激素促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL95-2和KLE中KLK4的表達(dá)上調(diào)，其上調(diào)途徑與ER狀態(tài)無關(guān)；雌激素調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞KLK4的表達(dá)是通過MAPK信號通路介導(dǎo)的，這是一種雌激素非ER依賴的調(diào)控模式。④KLK4特異性敲除后能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡及使子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，提示KLK4與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的凋亡和增殖相關(guān)，這種生物