慢病毒介導(dǎo)hVEGF165-GFP基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療MODS后器官微血管密度變化的研究.pdf

1、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome MODS)是臨床重癥患者死亡的主要原因之一。其發(fā)病機(jī)制尚未明確，最新研究認(rèn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)使得自體修復(fù)功能障礙，并進(jìn)一步造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，從而引起MODS，同時(shí)這可能就是MODS的始發(fā)環(huán)節(jié)。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial

2、 progenitor cell，EPC)是成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，屬于干細(xì)胞群體，既可不斷增殖又能定向分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。EPC不僅參與人胚胎血管生成，同時(shí)也參與出生后血管新生和血管內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程，是目前研究損傷血管修復(fù)的熱點(diǎn)之一。
　　 大量的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)證明：當(dāng)組織受到一定程度的損傷時(shí)，循環(huán)及組織中EPC可以在組織內(nèi)分化為內(nèi)皮細(xì)胞替換功能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞、修補(bǔ)裸露的血管內(nèi)皮損傷區(qū)，并參與缺血或損傷組織內(nèi)新

3、血管生成，從而改善缺血器官的功能；然而，當(dāng)機(jī)體受到過度的損傷刺激時(shí)，EPC的分化、遷徙功能也會(huì)發(fā)生嚴(yán)重障礙，則會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷部位微循環(huán)嚴(yán)重?fù)p害而無法得到修復(fù)，從而發(fā)生器官功能障礙。
　　 研究顯示，VEGF基因修飾的EPC移植治療創(chuàng)傷后缺血性疾病，將可能最大程度的發(fā)揮兩者促血管再生作用，移植VEGF基因修飾的EPC可以顯著降低MODS的發(fā)生率，并改善MODS的預(yù)后。為此，本文從EPC對(duì)自體修復(fù)的角度出發(fā)，探討攜帶VEGF-綠熒光蛋白

4、(Green Fluorescent Portein，GFP)雙表達(dá)基因慢病毒轉(zhuǎn)染EPC后的細(xì)胞特性及移植慢病毒介導(dǎo)hVEGF165-GFP基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞預(yù)防和治療MODS的理論依據(jù)。
　　 本研究共分為四部分，首先通過內(nèi)毒素+失血性休克制造出MODS的家兔動(dòng)物模型，同時(shí)在體外建立起EPC培養(yǎng)和鑒定體系，由慢病毒(LV)轉(zhuǎn)染VEGF-GFP雙表達(dá)基因的EPC，將體外培養(yǎng)增殖轉(zhuǎn)染EPC移植入MODS的動(dòng)物，觀察移植后MODS

5、的發(fā)生率和重要臟器的微血管密度改變情況，評(píng)價(jià)移植轉(zhuǎn)染VEGF-GFP雙表達(dá)基因的EPC防治MODS的效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 第一部分多器官功能障礙動(dòng)物模型的建立
　　 在本研究的第一部分我們首先成功地復(fù)制了雙相遲發(fā)型的家兔MODS模型，為創(chuàng)傷后多器官功能障礙的相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 將體重2.52±0.27Kg健康雄性家兔隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組(MODS)12只，施行失血性休克+內(nèi)毒素血癥

6、復(fù)合因素；對(duì)照組(C)12只，施行假手術(shù)，予以頸動(dòng)靜脈置管，不實(shí)施失血及內(nèi)毒素注射。監(jiān)測(cè)各重要器官功能變化，并行主要器官病理形態(tài)學(xué)檢查(大體、光鏡)。結(jié)果顯示各重要器官功能下降或衰竭。病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為炎癥為主的非特異性改變。實(shí)驗(yàn)組MODS發(fā)生率為83.3％，死亡率為75.0％，顯著高于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)采用二次打擊，與臨床實(shí)際相符，且MODS的發(fā)生率及死亡率均高，操作簡(jiǎn)單，容易復(fù)制，是一個(gè)較成功的動(dòng)物模型。
　　 第二部分?jǐn)y帶V

7、EGF-GFP雙表達(dá)基因慢病毒載體的建立及體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞
　　 本部分通過建立可穩(wěn)定攜帶VEGF+GFP的雙表達(dá)基因的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞，為下一步的回輸治療提供充足的細(xì)胞源。
　　 hVEGF165的PCR引物并擴(kuò)增，經(jīng)酶切、連接轉(zhuǎn)化至含GFP的慢病毒表達(dá)載體：pWPXL-MOD后挑取陽性克隆，利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、MluⅠ雙酶切后經(jīng)電泳鑒定并測(cè)序。含VDGF-GFP的表達(dá)載體pWPXL-M

8、OD與慢病毒包裝質(zhì)粒：pRsv-REV，pMDlg-pRRE，及包膜質(zhì)粒pMD2G共同組成四質(zhì)粒系統(tǒng)，通過磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后獲得慢病毒顆粒，經(jīng)濃縮后可獲得高滴度的LV-VEGF-GFP。在MOI值=50的條件下與EPC共培養(yǎng)以感染EPC。對(duì)LV/hVEGF165-GFP-EPC進(jìn)行增殖功能進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，目的基因插入慢病毒過表達(dá)載體pWPXL-MOD后經(jīng)PCR擴(kuò)增，證實(shí)載體片段與目的片段均可表達(dá)，并且基因測(cè)序報(bào)告顯示：重組

9、質(zhì)粒中的插入片段序列與目的基因VEGF的CDS序列一致，成功構(gòu)建并包裝了慢病毒載體，并證實(shí)EPC經(jīng)LV/hVEGF165-GFP轉(zhuǎn)染后其增殖功能較未轉(zhuǎn)染EPC提高。
　　 第三部分慢病毒介導(dǎo)hVEGF165-GFP基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療MODS后器官微血管密度變化及意義
　　 本部分旨在探討移植慢病毒介導(dǎo)hVEGF165-GFP基因轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)家兔創(chuàng)傷后多器官功能障礙治療的有效性和安全性的研究，同時(shí)比較單純移植

10、EPC治療MODS的療效差異。
　　 構(gòu)建動(dòng)物模型，將達(dá)到MODS的動(dòng)物隨機(jī)分為三組，單純EPC移植組(ET)12只和轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組(VT)12只，在固定時(shí)間點(diǎn)，分別以1×107個(gè)細(xì)胞/Kg(體重)的劑量進(jìn)行移植治療。同時(shí)以未行任何干預(yù)的MODS(M組，12只)作為對(duì)照細(xì)。
　　 結(jié)果顯示：慢病毒介導(dǎo)hVEGF165-GFP基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植組(VT)的MODS發(fā)生率和動(dòng)物死亡率均低于單純移植EPC組(ET)和