轉(zhuǎn)染heNOS基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞靶向移植治療動(dòng)力型肺動(dòng)脈高壓的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因重組腺病毒載體(Ad．CMV-heNOS)的構(gòu)建 目的:構(gòu)建攜帶人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因的重組腺病毒載體Ad．CMV-heNOS，同步構(gòu)建攜帶報(bào)告基因——增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒載體Ad．CMV-EGFP。 方法:將heNOS基因插入載體PSUCMV中構(gòu)建重組質(zhì)粒PSUCMV-heNOS，后者經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后與5型腺病毒右臂的質(zhì)粒Pbhge3通過(guò)Lipofectamin

2、e2000共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，制備攜帶人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因的重組腺病毒載體Ad．CMV-heNOS，鑒定正確后體外擴(kuò)增、純化并測(cè)定滴度。同法構(gòu)建重組腺病毒載體Ad．CMV-EGFP并測(cè)定滴度。 結(jié)果:重組質(zhì)粒PSUCMV-heNOS經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確。PCR檢測(cè)證實(shí)PSUCMV-heNOS與Pbhge3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞所得腺病毒載體Ad．CMV-heNOS構(gòu)建成功，經(jīng)擴(kuò)增純化后測(cè)定病毒滴度為5．15×109pfu／ml。

3、同法構(gòu)建的Ad．CMV-EGFP滴度為3．8x109pfu／ml。 結(jié)論:成功構(gòu)建并純化得到了高滴度重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad．CMV-heNOS和Ad．CMV-EGFP，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中高效基因轉(zhuǎn)染做好準(zhǔn)備。 第二部分大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)分離、培養(yǎng)并向內(nèi)皮細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的方法和條件。 方法:從大鼠骨髓中通過(guò)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)差

4、速貼壁后取二次貼壁細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)培養(yǎng)2w。以Dil-ac-LDL、FITC-UEA一1雙熒光染色法以及vWF、Flk-1免疫熒光染色法鑒定EPC；流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)EPC純度；細(xì)胞培養(yǎng)液一氧化氮(NO)含量測(cè)定分析EPC功能。 結(jié)果:二次貼壁細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后3d開始伸展，5d形成集落，7．10d增殖加速并出現(xiàn)條索狀結(jié)構(gòu)，2w大部分細(xì)胞呈多角形。Dil-ac-LDL、FITC-UEA．1雙染，vWF及Flk．1免疫熒光染色

5、陽(yáng)性率均大于70％。FACS檢測(cè)其中vWF陽(yáng)性細(xì)胞占77．93％，F(xiàn)lk．1陽(yáng)性細(xì)胞占81．50％。二次貼壁并經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量明顯高于普通培養(yǎng)的細(xì)胞，但低于成熟內(nèi)皮細(xì)胞(P<0．05)。 結(jié)論:通過(guò)差速貼壁并經(jīng)選擇性誘導(dǎo)培養(yǎng)可以從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)出純度較高的具備內(nèi)皮細(xì)胞部分特征的EPC。 第三部分大鼠動(dòng)力型肺動(dòng)脈高壓模型的建立 目的:研究不同比例肺組織切除后對(duì)大鼠體、肺動(dòng)脈壓、右心室肥厚程度和肺

6、血管重構(gòu)的影響，以期建立一種新的大鼠動(dòng)力型肺動(dòng)脈高壓模型。 方法:68只8w齡Wister大鼠分為右肺全切除組(組I)、左肺全切除組(組II)、右肺上中二葉切除組(組III)、假手術(shù)組(組Ⅳ)和陰性對(duì)照組(組V)。手術(shù)后4w測(cè)定各組大鼠體、肺動(dòng)脈收縮壓，檢測(cè)右心室肥厚指標(biāo)(RV／(LV+S))以及肺血管顯微形態(tài)學(xué)指標(biāo)——肺肌型小動(dòng)脈相對(duì)中膜面積(RMA)及其占肺小血管的百分比(SMA％)。 結(jié)果:組I大鼠4w后存活率66

7、．7％(12／18)，存活大鼠體重較組Ⅳ、V減輕(P<0．05)。組I肺動(dòng)脈收縮壓、RV／(LV+S)、RMA及SMA％均明顯高于其它四組(P<0．01)；組II、組ⅡI之間各指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P＞0．05)；組Ⅳ、V之間各指標(biāo)也無(wú)顯著性差異(P＞O．05)；組IIRMA明顯高于組Ⅳ、V(P<0．05)；組III肺動(dòng)脈收縮壓和RMA均明顯高于組Ⅳ、V(P<0．05)；五組大鼠體動(dòng)脈收縮壓無(wú)顯著性差異(P>O．05)。 結(jié)論:大鼠

8、右肺全切除術(shù)后w可形成明顯肺動(dòng)脈高壓、右心室肥厚和肺小血管重構(gòu)，而對(duì)體動(dòng)脈壓影響不大。與其它動(dòng)力型肺動(dòng)脈高壓模型相比，該法操作簡(jiǎn)便，死亡率較低，實(shí)驗(yàn)周期較短，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。而左肺全切除和右肺上中二葉切除術(shù)后4w肺動(dòng)脈壓和肺血管結(jié)構(gòu)雖有一定的變化，但相對(duì)不明顯。 第四部分Ad．CMV-heNOS體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，并抑制離體平滑肌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究 目的:了解重組腺病毒載體對(duì)大鼠骨髓來(lái)源EPC的轉(zhuǎn)染效率，觀察Ad．C

9、MV-heNOS轉(zhuǎn)染EPC后heNOS基因的表達(dá)情況以及對(duì)離體平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖的影響。 方法:以不同MOI值的腺病毒載體Ad．CMV-EGFP體外轉(zhuǎn)染EPC，流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率。Ad．CMV-heNOS以MOI=50轉(zhuǎn)染EPC后，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中heNOSmRNA的轉(zhuǎn)錄水平，免疫組化染色法、Western-Blot法檢測(cè)heNOS蛋白的表達(dá)水平，硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平。將EPC按干預(yù)

10、方式不同分為Ad．CMV-heNOS轉(zhuǎn)染組、空載體Ad．CMV轉(zhuǎn)染組以及PBS"轉(zhuǎn)染”組，各組EPC與大鼠SMC(EGFP標(biāo)記)混合培養(yǎng)72h后，F(xiàn)ACS檢測(cè)混合細(xì)胞中SMC所占百分比(SMC％)；將各組EPC與SMC非混合性共培養(yǎng)24h后，F(xiàn)ACS檢測(cè)SMC細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果:隨著MOI值逐漸增大，Ad．CMV-EGFP體外轉(zhuǎn)染EPC的轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率也逐漸增高，MOI=50時(shí)陽(yáng)性率可達(dá)85％以上，MOI再增大，陽(yáng)性

11、率增高有限。RT-PCR、免疫組化、Western-blot等方法證明：MOI=50時(shí)Ad．CMV-heNOS可成功將heNOS基因轉(zhuǎn)入EPC中并有正確的表達(dá)；而且與對(duì)照組相比，Ad．CMV-heNOS轉(zhuǎn)染組的EPC培養(yǎng)液中NO含量更高。EPC經(jīng)不同方式干預(yù)后與SMC以1：1混合培養(yǎng)72h，在細(xì)胞總數(shù)相似的情況下，Ad．CMV-heNOS轉(zhuǎn)染組的SMC％較其它兩組明顯降低(P<0．05)。EPC與SMC經(jīng)非混合性共培養(yǎng)24h后，與陰性對(duì)

12、照相比，Ad．CMV-heNOS轉(zhuǎn)染組更多SMC仍處于G1期(P＜0．01)；空載體轉(zhuǎn)染組和PBS“轉(zhuǎn)染”組SMC細(xì)胞周期相似，處于G1期的比例低于Ad．CMV-heNOS轉(zhuǎn)染組(P<0．05)而高于陰性對(duì)照(P

13、達(dá)，且能催化更多NO生成。在體外共培養(yǎng)體系中，EPC可干擾SMC細(xì)胞周期的運(yùn)行，抑制SMC的增殖，而轉(zhuǎn)染heNOS基因的EPC這種抑制作用更強(qiáng)。 第五部分轉(zhuǎn)染heNOS基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞靶向移植治療大鼠動(dòng)力型肺動(dòng)脈高壓的實(shí)驗(yàn)研究 目的:研究轉(zhuǎn)基因EPC經(jīng)頸靜脈注射途徑移植入動(dòng)力型肺動(dòng)脈高壓(HPH)大鼠體內(nèi)后的存活及分布規(guī)律；轉(zhuǎn)染heNOS基因的EPC能否在大鼠體內(nèi)正確表達(dá)heNOS、并起到緩解肺動(dòng)脈高壓病理改變、降低肺動(dòng)

14、脈壓的作用。 方法:建立大鼠HPH模型，將轉(zhuǎn)染EGFP基因的EPC經(jīng)頸靜脈注射途徑移植入HPH大鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)(Id、3d、1w、2w)處死動(dòng)物并取出肺、心、肝、腎行快速冰凍切片，觀察綠色熒光細(xì)胞在各器官中的分布規(guī)律。將40只HPH大鼠按干預(yù)方式隨機(jī)分為：轉(zhuǎn)染heNOS基因的EPC移植組(組I)、轉(zhuǎn)染空載體的EPC移植組(組II)、單純EPC移植組(組III)和PBS液移植組(組Ⅳ)，干預(yù)后2w測(cè)定各組大鼠體、肺動(dòng)脈收縮壓

15、，檢測(cè)RV／(LV+S)以及肺肌型小動(dòng)脈RMA和SMA％；通過(guò)RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)各組大鼠肺組織中heNOS表達(dá)；同時(shí)以WesternBlot比較組I大鼠肺與心、肝、腎中heNOS表達(dá)水平的差異。 結(jié)果:EGFP標(biāo)記的EPC移植后1d和3d肺組織切片中可發(fā)現(xiàn)較多熒光細(xì)胞，1w以后熒光強(qiáng)度逐漸減弱，2w時(shí)仍可見(jiàn)熒光細(xì)胞分布于肺小血管壁上，有的已成為血管內(nèi)皮的一部分；而各時(shí)間點(diǎn)心、肝、腎組織切片中僅在個(gè)別視野偶見(jiàn)

16、熒光細(xì)胞。各組大鼠經(jīng)不同方式干預(yù)2w后，組I肺動(dòng)脈收縮壓、RV／(LV+S)、RMA和SMA％均顯著低于組Ⅳ(P<0．01)；組II、Ⅲ之間各指標(biāo)差異不顯著(P>0．05)，但均明顯低于組Ⅳ(P<0．05)而高于組I(P<0．05)(SMA％除外)；四組大鼠體動(dòng)脈收縮壓無(wú)顯著性差異(P＞O．05)。RT-PCR和WesternBlot證實(shí)組I大鼠肺組織中有heNOS的正確表達(dá)，而WesternBlot同時(shí)發(fā)現(xiàn)：與肺組織相比，組I大鼠心、