表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(PAH)是心血管外科領(lǐng)域內(nèi)常見的并發(fā)癥，尤其見于先天性心臟病。其基本病理改變?yōu)橐匝鼙谥心て交≡錾鸀樘攸c(diǎn)的血管重構(gòu)。以往研究表明肺血管壁平滑肌增殖增生是受內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的嚴(yán)密調(diào)控的。而由于肺高灌注所引起的肺動(dòng)脈高壓的病理改變中，肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞往往受損、壞死及功能異常，導(dǎo)致局部細(xì)胞因子分泌紊亂，誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞增殖增生，肺血管重構(gòu)。近年來，在外周血中發(fā)現(xiàn)具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞，此類細(xì)胞可以遷移

2、到受損組織局部并分化為有正常分泌功能的內(nèi)皮細(xì)胞。因此內(nèi)皮祖細(xì)胞可以既作為內(nèi)皮組織修復(fù)工具，又可同時(shí)作為有效的目的基因載體。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)具 有強(qiáng)大的肺血管舒張及抑制平滑肌增殖的作用，在肺動(dòng)脈高壓的病理過程中其水平，以往研究證實(shí)CGRP通過與血管壁平滑肌細(xì)胞表面的CGRP受體結(jié)合，明顯緩解肺動(dòng)脈高壓。本研究將外源性CGRP基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，并將攜帶外源CGRP基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞通過頸靜脈注射給左向右分流引起的肺動(dòng)脈高壓的大鼠

3、模型，觀察其緩解肺動(dòng)脈高壓及抑制肺血管重構(gòu)的治療作用，以期為肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 本研究采用外周血單個(gè)核細(xì)胞密度梯度離心的方法采集外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞因子的定向誘導(dǎo)分化，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)至一周，利用 DiI-acLDL，F(xiàn)ITC-Ulcx-lectin雙熒光顯色法及CD34， CD133細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)(FACS)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定。根據(jù)CGRP全長cDNA序列設(shè)計(jì)

4、一對(duì)CGRP開放閱讀框上下游引物，并分別引入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，以pGEM-T-CGRP為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物與真核表達(dá)載體pEGFP-N1進(jìn)行EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切，酶切產(chǎn)物片段經(jīng)過純化后，進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli DH5α，轉(zhuǎn)化子經(jīng)過質(zhì)粒擴(kuò)增提取后，經(jīng)電穿孔法轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，并通過放射免疫方法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中CGRP濃度，證實(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染外

5、源質(zhì)粒基因并且可分泌CGRP。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分成2×10<'6> cells/mL 小單位準(zhǔn)備進(jìn)行靜脈注射。將6-8周齡的無胸腺裸大鼠隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、左向右分流組、分流+EPC移植組及分流+CGRP-EPC移植組。通過腹主動(dòng)脈與相鄰下腔靜脈之間建立左向右分流通道，飼養(yǎng)10周，以完成動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的建立。以1×10<'6> EPCs，1×10<'6>CGRP-EPCs(均為500uL)分別經(jīng)過頸靜脈注射給分流+EPC移植

6、組及分流+CGRP-EPC移植組，繼續(xù)飼養(yǎng)4周。以右心導(dǎo)管法測量各組大鼠肺動(dòng)脈壓力，通過熱稀釋方法測量肺血管阻力(PVR)，取大鼠肺葉組織，利用放射免疫方法測定肺組織內(nèi)以及血漿中的CGRP含量，同時(shí)提取肺組織內(nèi)的RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定CGRP mRNA含量。針對(duì)大鼠CD31抗原，采用小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測EPC在肺組織內(nèi)的分布。肺葉組織進(jìn)行切片，HE染色，并利用計(jì)算機(jī)圖象分析技術(shù)檢測

7、肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)變化并進(jìn)行組間比較，切取肺組織小塊(1mm×1mm×1mm)，系列脫水固定后，進(jìn)行透射電鏡觀察各組肺小動(dòng)脈壁超微結(jié)構(gòu)變化。另外取24只大鼠隨機(jī)分為3組，進(jìn)行分流手術(shù)后分別接受EPC移植，CGRP-EPC移植，其余一組不接受細(xì)胞移植，采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析。 結(jié)果： 1．從人外周血中分離的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，3天后可見細(xì)胞伸展，并見梭形細(xì)胞：5天形成細(xì)胞集落，約一周左右形成典型的

8、鋪路石樣結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞團(tuán)，中間為圓形細(xì)胞，貼壁的梭型細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)的周圍向外生長，第10天左右可見首尾相連形成條索狀結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡下可觀察到同時(shí)發(fā)綠色(DiI-acLDL)和紅色(HTC-Ulcx-lcctin)熒光的雙陽性貼壁細(xì)胞。FACS檢測，CD34 陽性率為 77.2％±10.9％，和AC133陽性率為27.1％±9.1％。 2．重組質(zhì)粒pEGFP-N1-CGRP經(jīng)酶切鑒定正確。體外經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染陽性率

9、為46％。轉(zhuǎn)染CGRP基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞24小時(shí)后對(duì)其培養(yǎng)液經(jīng)放免測定發(fā)現(xiàn)有CGRP分泌，并且于第5天其分泌值達(dá)到高峰，分泌持續(xù)達(dá)3周以上。分流手術(shù)的大鼠接受CGRP-EPC后其肺組織內(nèi)CGRP的含量較單純分流手術(shù)組的大鼠顯著增加(P<0.05)，在所有接受分流手術(shù)大鼠的血漿中CGRP含量均較對(duì)照組降低，而接受分流手術(shù)的3組大鼠之間并無顯著差異(P>0.05)。 3．細(xì)胞移植4周后經(jīng)過RT-PCR檢測各組大鼠肺組織內(nèi)的CGRP m

10、RNA 均有表達(dá)，而接受CGRP-EPC移植的實(shí)驗(yàn)組大鼠其肺組織內(nèi)的CGRPmRNA 含量明顯高于其余3組大鼠(P<0.05)。 4．免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞移植4周后，接受CGRP-EPC移植的實(shí)驗(yàn)組大鼠的肺組織血管床散在有綠色熒光分布，在其余3組大鼠的肺組織內(nèi)未見綠色熒光分布；在CGRP-EPC組大鼠的心臟，肝臟以及腎臟等主要器官內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)有明顯的綠色熒光分布。 5．肺組織切片染色病理檢查發(fā)現(xiàn)接受EPC或是CGRP-E

11、PC移植組大鼠的肺小動(dòng)脈管壁面積百分比同單純分流組相比較均顯著降低(P<0.05)，而管腔面積百分比卻顯著增加(P<0.05)；經(jīng)過計(jì)算機(jī)定量分析分流組大鼠的肺小動(dòng)脈管壁厚度較對(duì)照組明顯增加，而接受EPC或是CGRP-EPC移植組大鼠的肺小動(dòng)脈管壁增厚程度較單純分流組顯著減輕(P<0.05)；CGRP-EPC組較EPC組比較其減輕程度更加明顯(P<0.05)。 6．肺小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)在單純分流組大鼠其肺小動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞

12、腫脹增大，并見內(nèi)皮細(xì)胞壞死從管壁脫落現(xiàn)象，內(nèi)彈力膜崩解，細(xì)胞外基質(zhì)以及膠原纖維堆積；在EPC移植組發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞變性與再生同時(shí)并存，內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜連接較為疏松；而在CGRP-EPC移植組中見到再生的內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜連接較為緊密，細(xì)胞形態(tài)接近正常，細(xì)胞的變性壞死現(xiàn)象減少。 7．血流動(dòng)力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)單純接受分流手術(shù)組大鼠的平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)及肺血管阻力(PVR)均較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；接受EPC或是CGRP-EPC

13、移植組大鼠的肺血管阻力與單純分流組相比均有所降低(P<0.05)，而CGRP-EPC移植組的肺血管阻力明顯低于EPC組(P<0.05)；肺動(dòng)脈壓力在單純分流組與EPC移植組之間無顯著差別(P>0.05)，而CGRP-EPC移植組的肺動(dòng)脈壓力卻較單純分流組和EPC移植組有明顯降低(P<0.05)。體循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)(血壓、心率、心輸出量、體循環(huán)血管阻力)在4組之間無明顯差異(P均>0.05)。 8．對(duì)Kaplan-Meier生存

14、分析顯示CGRP-EPC移植組大鼠的生存率顯著高于分流組(P<0.05)，而EPC移植組的生存率與分流組相比并未見顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1．從人類外周血分離出的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)可以得到具有生物活性和分化潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞用于細(xì)胞移植。 2．可以人工構(gòu)建包含外源CGRP基因的真核質(zhì)粒表達(dá)載體，通過體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，產(chǎn)生并分泌具有生物學(xué)活性的CGRP。 3．內(nèi)皮祖細(xì)胞在體內(nèi)可以