hHIF-1α基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高血壓的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　肺動(dòng)脈高壓是以肺血管阻塞性病變導(dǎo)致肺血管阻力進(jìn)行性升高為特征的嚴(yán)重肺血管疾病。其主要病理改變是外周肺小動(dòng)脈中膜增生肥厚，肺小血管閉塞和肺細(xì)小動(dòng)脈叢樣病變。而高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓主要是由于體-肺分流的異常血流動(dòng)力學(xué)引起，為先天性心臟病患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是影響患者生存和生活質(zhì)量非常重要的因素，隨著病情進(jìn)展，臨床處理困難，致死率極高。目前擴(kuò)血管藥物對(duì)肺動(dòng)脈高壓治療的長(zhǎng)期療效無(wú)法令人滿意，而干細(xì)胞移植的血管新生治療方式已

2、經(jīng)在各個(gè)疾病的研究領(lǐng)域取得了新進(jìn)展。內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類存在于外周血與骨髓中，并且能夠增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它能夠結(jié)合到缺血或者損傷的內(nèi)皮部位參與新生血管的形成，另外內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)于缺血缺氧性疾病治療的遠(yuǎn)期療效已經(jīng)得到了證實(shí)。低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是廣泛存在于體內(nèi)能夠參與血管新生的轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體缺氧時(shí)能夠增加血管床的數(shù)量從而改善缺血缺氧，其生物活性主要取決于HIF-1α亞基。內(nèi)皮祖細(xì)胞和低氧誘導(dǎo)因子對(duì)于改善組織缺血缺

3、氧有協(xié)同作用，因此我們推測(cè)，在體外，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)將HIF-1α轉(zhuǎn)染入內(nèi)皮祖細(xì)胞，高表達(dá)HIF-1α的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植入體內(nèi)能夠協(xié)同參與新生血管的形成、減輕肺動(dòng)脈高壓并且逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，從而為先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓患者未來(lái)的基因和干細(xì)胞治療提供理論依據(jù)。
　　目的:
　　1.探討并構(gòu)建一種可靠、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型，并確定能夠成功建立可逆或者不可逆的肺高壓模型的時(shí)間，為肺高壓的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　

4、2.利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞并純化鑒定，為內(nèi)皮祖細(xì)胞移植提供條件。
　　3.構(gòu)建并鑒定人HIF-1α（hHIF-1α）慢病毒表達(dá)載體，慢病毒介導(dǎo)hHIF-1α體外轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞，確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)及轉(zhuǎn)染效率并觀察轉(zhuǎn)染后內(nèi)皮祖細(xì)胞在低氧環(huán)境下的生長(zhǎng)狀態(tài)和hHIF-1α的表達(dá)。
　　4.將高表達(dá)hHIF-1α的內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)靜脈途徑移植到高動(dòng)力肺動(dòng)脈高壓模型兔體內(nèi)，觀察肺血管血流動(dòng)力學(xué)和肺組織病理變化

5、，探討單純內(nèi)皮祖細(xì)胞移植和高表達(dá)hHIF-1α的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)肺動(dòng)脈高壓的不同影響，證實(shí)其對(duì)肺高壓治療作用的血管新生機(jī)制。
　　方法:
　　1.取1月齡新西蘭白兔進(jìn)行頸總動(dòng)脈-頸內(nèi)靜脈套管法和直接縫合吻合法兩種分流手術(shù)，比較兩種分流手術(shù)方式的優(yōu)缺點(diǎn)。手術(shù)后1、2、3、6和12個(gè)月，通過(guò)右心導(dǎo)管術(shù)分別測(cè)量肺動(dòng)脈收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓，為了排除套管和縫合吻合的分流對(duì)肺動(dòng)脈壓力的影響，我們?cè)诜至餮軍A閉前后分別測(cè)定肺動(dòng)脈壓力。稱量

6、右心室和左心室+室間隔重量，計(jì)算右心室和左心室+室間隔重量的比值[RV/(LV+S)]來(lái)評(píng)估右心室肥厚程度。動(dòng)物處死后制作肺組織病理切片，HE染色觀察肺血管病理形態(tài)變化并通過(guò)Heath-Edwards分級(jí)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，觀察術(shù)后不同時(shí)間段各組肺血管病理形態(tài)及Heath-Edwards分級(jí)情況，從而確定分流手術(shù)后導(dǎo)致的可逆或者不可逆肺動(dòng)脈高壓形成的時(shí)間。
　　2.取新西蘭白兔雙下肢股骨骨髓，淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后，取中間云霧狀單個(gè)核

7、細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，EGM-2內(nèi)皮祖細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞并進(jìn)行傳代純化。體外培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞不同時(shí)間的形態(tài)，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的CD34、CD133和VEGFR-2表面抗原表型，Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1熒光染色法鑒定細(xì)胞的雙吞噬功能。同時(shí)用CM-DiL標(biāo)記細(xì)胞，觀察細(xì)胞標(biāo)記率以及標(biāo)記后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　3.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中hHIF-1α序列設(shè)計(jì)引物，以hHIF-1αc

8、DNA作為模板做PCR擴(kuò)增，NheI和BamHI雙酶切重組克隆hHIF-1α質(zhì)粒和空白載體。參照Invitrogen公司ViraPower慢病毒包裝系統(tǒng)的方法進(jìn)行hHIF-1α慢病毒的包裝，并測(cè)定慢病毒滴度。取培養(yǎng)2周的EPCs傳代于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)滿意后進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。按照MOI值=0、5、10、20、50、100、200分別加入慢病毒液，同時(shí)加入Polybrene(8μg/ml)，置于37℃低氧培養(yǎng)箱中(1％O2，5％CO2和94％

9、N2)培養(yǎng)。培養(yǎng)48-96小時(shí)后倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，倒置熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，確定最佳MOI值。轉(zhuǎn)染成功后，Westernblot檢測(cè)hHIF-1α在EPCs中的表達(dá)情況。
　　4.新西蘭白兔按照頸總動(dòng)脈-頸內(nèi)靜脈吻合的方式建立高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型，術(shù)后4、8和12周分別做超聲心動(dòng)圖檢測(cè)吻合口的通暢度及心功能情況，12周后均通過(guò)右心導(dǎo)管術(shù)檢測(cè)肺動(dòng)脈壓力。所有成功建立肺動(dòng)脈高壓模型和假手術(shù)組的新西蘭

10、白兔被隨機(jī)分為6組，每組10只。假手術(shù)組:僅頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)靜脈分離;空白對(duì)照組:建立肺動(dòng)脈高壓模型后不做任何處理;EPCs組:通過(guò)左側(cè)頸內(nèi)靜脈行單純EPCs移植;hHIF-1-EPCs組:通過(guò)左側(cè)頸內(nèi)靜脈行轉(zhuǎn)染后高表達(dá)hHIF-1α的EPCs移植;EPCs對(duì)照組:通過(guò)左側(cè)頸內(nèi)靜脈行轉(zhuǎn)染空載體的EPCs移植;培養(yǎng)基組:僅通過(guò)左側(cè)頸內(nèi)靜脈向模型兔注射EGM-2培養(yǎng)基。2周后通過(guò)右心導(dǎo)管術(shù)檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，處死動(dòng)物后行肺組織病理切片，HE染

11、色觀察肺血管病理變化，計(jì)算肺小動(dòng)脈的管壁厚度指數(shù)及相對(duì)管壁面積指數(shù)。冰凍切片行免疫熒光檢測(cè)觀察移植的EPCs在肺組織中的分布，Westernblot檢測(cè)肺組織hHIF-1α的表達(dá)。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺組織Ⅷ因子以觀察各組肺組織毛細(xì)血管密度，明確EPCs和轉(zhuǎn)染hHIF-1α的EPCs移植對(duì)肺血管數(shù)量的影響。
　　結(jié)果:
　　1.套管組建立模型從麻醉到結(jié)束的平均手術(shù)時(shí)間為1.40±0.12h，吻合組為1.48±0.21h。

12、套管組的死亡率為27.5％(11/40)，吻合組死亡率為12.5％(5/40)。手術(shù)后2個(gè)月至12個(gè)月，與假手術(shù)組相比，套管組和吻合組在分流血管夾閉前均有明顯增高的肺動(dòng)脈收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓和RV/(LV+S)(P＜0.05)。雖然分流血管夾閉后，肺動(dòng)脈壓力有所下降，但是肺動(dòng)脈收縮壓和平均肺動(dòng)脈壓力仍明顯增高于假手術(shù)組(P＜0.05)。而套管組和吻合組的肺動(dòng)脈收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓和RV/(LV+S)無(wú)明顯差異。通過(guò)Heath-Edwar

13、ds分級(jí)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，套管組和吻合組肺組織在術(shù)后3個(gè)月出現(xiàn)可逆肺動(dòng)脈高壓病理改變，6個(gè)月后出現(xiàn)不可逆肺動(dòng)脈高壓病理改變。
　　2.梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)，24小時(shí)開(kāi)始貼壁，培養(yǎng)7天后細(xì)胞可形成典型集落，2周以后即出現(xiàn)克隆性生長(zhǎng)的EPCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面CD34、CD133和VEGFR-2的陽(yáng)性表達(dá)均占80％-95％，雙熒光染色可見(jiàn)90％的貼壁細(xì)胞都能夠特異性的攝取Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1

14、。CM-DiL標(biāo)記細(xì)胞2天后，倒置熒光顯微鏡可見(jiàn)95％的細(xì)胞胞漿和胞膜均被染成紅色，少量次數(shù)傳代后紅色熒光無(wú)明顯衰減，并且標(biāo)記對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。
　　3.hHIF-1α慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建并包裝后，轉(zhuǎn)染293TN細(xì)胞可見(jiàn)明顯綠色熒光，測(cè)慢病毒滴度:hHIF-1α慢病毒為1.5×107TU/ml，對(duì)照空載體慢病毒為5×108TU/ml。不同MOI轉(zhuǎn)染EPCs后，用倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MOI=100時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，

15、約為90％以上，并且細(xì)胞生長(zhǎng)良好，無(wú)明顯死亡，多次傳代后能夠穩(wěn)定表達(dá)。慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs96小時(shí)后行Westernblot，轉(zhuǎn)染hHIF-1α的EPCs組可見(jiàn)hHIF-1α蛋白表達(dá)，未轉(zhuǎn)染和空載體對(duì)照組無(wú)hHIF-1α表達(dá)，證明hHIF-1α已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染至EPCs中。
　　4.hHIF-1α轉(zhuǎn)染的EPCs移植后2周，與假手術(shù)組相比較，空白對(duì)照組和培養(yǎng)基組肺動(dòng)脈收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓和RV/(LV+S)明顯增高(P＜0.05)（假手術(shù)

16、組分別為:13.3±1.636mmHg，8.97±1.356mmHg和0.247±0.021;空白對(duì)照組分別為:35.4±2.066mmHg，23.1±1.331mmHg和0.436±0.034;培養(yǎng)基組分別為:35.9±2.132mmHg，23.4±1.389mmHg和0.433±0.026）?？瞻讓?duì)照組和培養(yǎng)基組之間無(wú)明顯差異。與空白對(duì)照組相比，EPCs組和hHIF-1-EPCs組的肺動(dòng)脈收縮壓、平均肺動(dòng)脈壓和RV/(LV+S)明顯

17、降低(P＜0.05)（EPCs組分別為:24.5±4.301mmHg，17.3±2.908mmHg和0.353±0.056;hHIF-1-EPCs組分別為:15.4±1.897mmHg，10.3±1.515mmHg和0.278±0.029），但是hHIF-1-EPCs組比EPCs組降低更明顯(P＜0.05)。EPCs組和EPCs對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。冰凍切片顯示肺組織巾EPCs組的EPCs可呈現(xiàn)紅色熒光，hHIF-1-EPCs組的EPC

18、s可呈現(xiàn)綠色熒光。結(jié)果顯示2周后移植的EPCs主要定位于毛細(xì)血管周圍和肺泡周圍，并且有的已經(jīng)形成了小血管樣明顯環(huán)狀結(jié)構(gòu)。肺組織Westernblot檢測(cè)，hHIF-1-EPCs組出現(xiàn)hHIF-1α特殊表達(dá)的條帶，其余組均未見(jiàn)明顯條帶出現(xiàn)。肺組織病理切片HE染色觀察，與假手術(shù)組相比，空白對(duì)照組和培養(yǎng)基組的管壁厚度指數(shù)和相對(duì)管壁面積指數(shù)明顯增大(P＜0.05)，但空白對(duì)照組和培養(yǎng)基組之間無(wú)明顯差異。與空白對(duì)照組相比較，EPCs組和hHIF-

19、1-EPCs組的管壁厚度指數(shù)和相對(duì)管壁面積指數(shù)明顯降低(P＜0.05)，但是hHIF-1-EPCs組比EPCs組降低更明顯(P＜0.05)。EPCs組和EPCs對(duì)照組之間無(wú)明顯差異。免疫組織化學(xué)檢測(cè)Ⅷ因子，移植后EPCs組、hHIF-1-EPCs組和EPCs對(duì)照組毛細(xì)血管密度比空白對(duì)照組明顯增大(P＜0.05)（EPCs組:4.50±1.354/mm2;hHIF-1-EPCs組:8.20±1.814/mm2;EPCs對(duì)照組:4.30±1

20、.337/mm2;空白對(duì)照組:2.30±1.494/mm2），并且hHIF-1-EPCs組血管密度增大更明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.頸總動(dòng)脈-頸內(nèi)靜脈吻合能夠成功建立可靠、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的兔高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型，術(shù)后3個(gè)月左右可以形成可逆性肺動(dòng)脈高壓，術(shù)后6個(gè)月以后可以形成不可逆肺動(dòng)脈高壓。
　　2.利用密度梯度離心法可以體外分離骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞，并且通過(guò)EGM-2培養(yǎng)基能夠定向誘導(dǎo)、傳代獲取大量的純