多藥耐藥基因介導(dǎo)的骨髓保護(hù)在荷瘤小鼠化療時(shí)的安全性研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見病、多發(fā)病。惡性腫瘤的治療以綜合性治療措施為主，包括手術(shù)、化療、放療、生物治療、免疫治療等。其中，化療在根治惡性腫瘤，防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面起著不可替代的作用。但臨床化療中存在兩大障礙影響化療的療效：一、腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性直接導(dǎo)致化療效果欠佳；二、化療藥物造成嚴(yán)重的骨髓抑制使化療方案不能順利實(shí)施而間接導(dǎo)致化療失敗。大量研究證實(shí)，影響化療療效的兩大障礙與多藥耐藥(multidrug

2、resistance gene 1，mdr1)基因有著密切的關(guān)系。腫瘤細(xì)胞由于過度表達(dá)mdrl基因而產(chǎn)生多藥耐藥性，使其對(duì)化療藥物不敏感而不能被有效殺滅；骨髓細(xì)胞極低水平的表達(dá)mdrl基因而對(duì)化療藥物異常敏感，使其極易被化療藥物損傷。本研究用含人mdr1全長cDNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染Balb/c雄性小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染后mdr1基因在靶細(xì)胞的表達(dá)情況；觀察轉(zhuǎn)染mdrl基因的造血細(xì)胞在移植到受體肝癌荷瘤Balb/c雌性小鼠后對(duì)造血

3、恢復(fù)的影響以及超劑量化療中mdr1基因的骨髓保護(hù)和腫瘤治療作用；探討mdrl基因轉(zhuǎn)染骨髓造血細(xì)胞移植后，化療時(shí)其在體內(nèi)的表達(dá)、分布和安全性以及在骨髓和外周血的富集效應(yīng)。 方法：對(duì)攜帶人mdrl全長cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317-HaMDRl/A用秋水仙堿進(jìn)行篩選；收集病毒上清液并濃縮，采用病毒上清轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染小鼠骨髓造血細(xì)胞；將轉(zhuǎn)染細(xì)胞從尾靜脈移植入經(jīng)60CO-γ放療預(yù)處理的Balb/c雌性小鼠H22肝癌模型體內(nèi)，然后用阿

4、霉素化療，檢測mdrl基因?qū)κ荏w骨髓的保護(hù)作用、超劑量化療對(duì)腫瘤的治療作用；同時(shí)采用熒光原位雜交(fluorescence in situhybridization，F(xiàn)ISH)、RT-PCR法和免疫組織化學(xué)法分別從基因、蛋白水平檢測外源性mdrl基因在受體骨髓、外周血、腫瘤組織及重要臟器的表達(dá)和分布情況；FISH檢測移植后骨髓的歸巢率，免疫組化法檢測移植后定植率；監(jiān)測造血功能變化及重要臟器影響，分析其安全性。 結(jié)果：(1)RT-

5、PCR法證實(shí)外源性mdrl基因可有效地整合到小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞基因組中并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)；(2)免疫組化法測得體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞P一糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達(dá)的陽性率為31.24％；(3)化療前骨髓細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)陽性率為(9.36±1.84)％、(8.52±1.26)％，化療后6周mdrl基因在骨髓單個(gè)核細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞有持續(xù)性表達(dá)，化療藥物劑量遞增時(shí)，P-糖蛋白表達(dá)陽性率增高；(4)RT-P

6、CR法和FISH證實(shí)外源性mdrl基因在重要臟器和腫瘤組織無表達(dá)；(5)化療中，轉(zhuǎn)染mdrl基因的荷瘤小鼠能耐受阿霉素常規(guī)劑量3倍的化療，同時(shí)腫瘤能被有效治療，荷瘤小鼠的生存率高于對(duì)照組(P＜0.05)，對(duì)照組荷瘤動(dòng)物死于超劑量化療所造成的嚴(yán)重骨髓抑制；(6)移植轉(zhuǎn)染組外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于移植未轉(zhuǎn)染組，化療第2周后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；(7)化療后第1周FISH檢測歸巢率為61.6％，免疫組化法測得mdr1基因骨髓定植率為(

7、9.73+1.64)％；(8)HE染色病檢和電鏡病理分析顯示，除肝、肺及小腸有炎性滲出和水腫病變外，其余無異常。 結(jié)論：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可在體外將外源性mdr1基因轉(zhuǎn)入小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染的mdr1基因能整合到骨髓單個(gè)核細(xì)胞基因組中并有功能性表達(dá)；外源性mdr1基因轉(zhuǎn)染移植后在小鼠骨髓和外周血單個(gè)核細(xì)胞有持續(xù)表達(dá)，在重要臟器和腫瘤組織無表達(dá)；mdr1基因轉(zhuǎn)染對(duì)外周血造血功能及重要臟器無明顯影響；隨化療藥物劑量遞增，P-g