針灸對CTX化療荷瘤小鼠骨髓細胞中Notch信號通路相關(guān)差異基因調(diào)控的研究.pdf

1、目的：骨髓抑制主要表現(xiàn)為外周血中白細胞降低，是化療最常見的毒副反應(yīng)之一，進而可引起身體機能狀態(tài)下降、抵抗力減弱、嚴重感染等嚴重不良反應(yīng)。根據(jù)我們前期已有的針灸抗骨髓抑制的研究基礎(chǔ)，本研究以與骨髓造血細胞發(fā)育過程中影響造血干／祖細胞的生存、增殖和分化方向有關(guān)的Notch信號通路為切入點，探討Notch信號通路上相關(guān)差異基因與針灸改善化療后不良反應(yīng)，保護骨髓造血細胞、改善骨髓抑制、增加外周血白細胞的相關(guān)作用途徑及分子生物學機制；探討針刺與艾

2、灸兩種療法在改善骨髓抑制，提升白細胞方面作用環(huán)節(jié)的異同。同時這一研究也可為針灸改善造血損傷類疾病提供新的治療方法和實驗室依據(jù)。
　　方法：選用清潔級，雄性昆明種(KM)小鼠40只，體重18±2g，小鼠在實驗室中自由飼養(yǎng)3天后進行植瘤（溫度20o～25℃，相對濕度60％左右）。在無菌操作臺上進行操作，把所需物品放在無菌操作臺上紫外線燈照射30min。抽取生理鹽水13.8ml放入三角燒瓶中。左手持傳代鼠，右手對小鼠腹部碘伏消毒，用1m

3、l注射器（5ml針頭）抽取腹水2.3ml，緩慢注入含13.8ml的生理鹽水的三角燒瓶中，輕輕混勻，達到7倍稀釋液。用1ml注射器（5ml針頭）抽取細胞稀釋液1ml，左手持鼠，右手先對40只小鼠左腋下碘伏消毒，再持注射器進行腋下注射，過程中針頭先刺入皮下，再緩慢向左腋下方向推進，到達腋窩內(nèi)再緩慢注入用瘤細胞53106/0.2ml細胞稀釋液，隨后邊推針邊旋轉(zhuǎn)針頭至90°出針，同時用無菌棉簽按壓針孔數(shù)秒，避免液體滲出，最后放開小鼠，手持其尾部

4、放入鼠籠中，完成植瘤。接種7天后，對荷瘤小鼠進行尾靜脈采血并查WBC總數(shù)，挑選白細胞接近正常范圍，瘤體生長良好的荷瘤小鼠32只（體質(zhì)量22±2g、瘤體直徑0.8cm左右），隨機分為4組，8只/組，即荷瘤空白組，荷瘤模型組，荷瘤針刺組，荷瘤艾灸組；分籠飼養(yǎng)，苦味酸對各組荷瘤小鼠進行染色編號。荷瘤模型組，荷瘤針刺組，荷瘤艾灸組的小鼠1次性腹腔注射環(huán)磷酰胺（CTX）150mg/kg，停藥后4h模型即成，荷瘤空白組小鼠腹腔注入同等劑量的生理鹽水

5、。各組荷瘤小鼠每次選取1只依次配對固定于自制鼠板上施以針刺和艾灸治療。荷瘤空白組，荷瘤模型組陪同固定不治療；荷瘤針刺組選取“大椎”、“膈俞”（雙）、“腎俞”（雙）、“足三里”（雙）選用江蘇無錫佳健牌美容毫針（規(guī)格：0.19cm310mm，針柄20mm），采用管式進針法直刺，進針深度為3mm，留針6min。每日1次，連續(xù)5天；荷瘤艾灸組選取“大椎”、“膈俞”（雙）、“腎俞”（雙）、“足三里”（雙）選用特制美容艾條（規(guī)格：0.4cm325c

6、m）點燃后，高于荷瘤小鼠穴位皮膚2cm處固定每穴懸灸3min，每日1次，連續(xù)5天。荷瘤空白組，荷瘤模型組同步固定，但不予治療。從荷瘤小鼠注射CTX之前一直到治療5天后，每天早上定時、按編號順序?qū)⒚恐恍∈蟾钗察o脈采血，光學顯微鏡下檢測外周血白細胞計數(shù)，治療5天后的第2天在干冰上取荷瘤小鼠雙側(cè)股骨和脛骨。課題組前期應(yīng)用小通量基因表達譜芯片初步篩選各組健康小鼠骨髓造血細胞中Notch信號通路相關(guān)差異基因；由于一方面健康小鼠與荷瘤小鼠為同一批次

7、，只是帶瘤體質(zhì)的不同，另一方面由于經(jīng)費原因，故在前期篩選的基礎(chǔ)上，運用免疫組化法對進一步篩選不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細胞中Notch信號通路相關(guān)差異基因蛋白表達情況；Realtime-PCR法分析不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細胞中Notch信號通路相關(guān)差異基因mRNA的轉(zhuǎn)錄情況；Western–Blot法進一步驗證不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細胞中Notch信號通路相關(guān)差異基因的蛋白表達量。闡釋調(diào)控 CTX化療荷瘤小鼠骨髓細胞中的Notch信號

8、通路是針灸減輕骨髓抑制、提升外周血白細胞等綜合作用的關(guān)鍵機制。
　　結(jié)果：
　?。?）“實驗一”結(jié)果顯示，荷瘤小鼠從注射CTX后的第2天外周血白細胞即降低。與荷瘤空白組比，治療后第3天荷瘤模型組、荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細胞計數(shù)降至最低（P<0.05），治療后第4天開始回升，與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細胞數(shù)回升幅度較大。治療后第5天，荷瘤模型組、荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細胞數(shù)均已接近基礎(chǔ)白細胞水平，且與荷瘤針刺

9、組、荷瘤艾灸組白細胞數(shù)高于荷瘤模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　（2）“實驗二”結(jié)果顯示，通過小通量基因表達譜芯片對健康小鼠進行初步篩選，由于考慮小鼠來至同一整體，只是帶瘤體質(zhì)不同，故沒有對荷瘤小鼠進行再次篩選，把篩選出的七個差異基因：notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2同樣作為差異基因進行下一步研究。
　?。?）“實驗三”結(jié)果顯示，運用免疫組化法對小通量基因表

10、達譜芯片初步篩選出的荷瘤小鼠骨髓造血細胞Notch信號通路相關(guān)差異基因進行進一步篩選，與荷瘤空白組比，荷瘤模型組中notch2和jag1、jag2蛋白表達含量降低，numb1和numb2蛋白表達含量升高，且具有顯著性差異（P<0.05）；Delta1、notch1差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組與荷瘤艾灸組中notch2和jag1蛋白表達含量降低，numb1和numb2蛋白表達含量升高，且具有顯著性差異（P<

11、0.05）；Delta1、notch1、jag2差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。故最后確定將具有顯著性差異的jag1、notch2、numb1、numb2基因進一步進行研究。
　?。?）“實驗四”結(jié)果顯示，運用RT-PCR法對荷瘤小鼠骨髓造血細胞Notch信號通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2的mRNA轉(zhuǎn)錄情況進行檢測。與荷瘤空白組比，荷瘤模型組 jag1、notch2蛋白表達含量升高但差異無統(tǒng)計

12、學意義（P>0.05），numb1、numb2蛋白表達含量降低，且 numb2具有顯著性差異（P<0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組jag1、notch2蛋白表達含量均有升高，numb1蛋白表達含量降低，但均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤艾灸組 numb2蛋白表達含量升高，具有顯著性差異（P<0.05）；與荷瘤針刺組比，荷瘤艾灸組 numb2蛋白表達含量高于荷瘤針刺組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05

13、）。
　?。?）“實驗五”結(jié)果顯示，運用Western-blot法對荷瘤小鼠骨髓造血細胞Notch信號通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2的蛋白表達情況進行檢測。與荷瘤空白組比，荷瘤模型組jag1、notch2蛋白表達含量升高且有顯著性差異（P<0.05），numb1、numb2蛋白表達含量降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組jag1、notch2蛋白表達含

14、量均降低，且具有顯著性差異（P<0.05），numb1、numb2蛋白表達含量升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與荷瘤針刺組比，荷瘤艾灸組 jag1、notch2蛋白表達含量均降低，numb1、numb2蛋白表達含量升高，差異雖無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但針刺有優(yōu)于艾灸的趨勢。
　　結(jié)論：
　　1.荷瘤小鼠白細胞基數(shù)比健康小鼠稍高。
　　2.針刺和艾灸可以減輕 CTX化療所致荷瘤小鼠骨髓抑制，提升外周血白細

15、胞，其療效確切與導師組前期研究結(jié)果一致，治療后第3天降至最低，第4天開始回升，第5天達到正常，且荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細胞數(shù)高于荷瘤模型組，針刺和艾灸兩種方法沒有顯著性差異。
　　3.課題組前期應(yīng)用小通量基因表達譜芯片初步篩選各組正常小鼠骨髓造血細胞中Notch信號通路相關(guān)差異基因；共篩選出七個差異基因：notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2。通過免疫組化法對小通量基因表達譜芯片初步

16、篩選出的荷瘤小鼠骨髓造血細胞Notch信號通路7個差異基因進一步篩選，確定jag1、notch2、numb1、numb2基因具有顯著性差異。
　　4.通過對上述指標的變化規(guī)律及相關(guān)性分析，闡釋針灸保護荷瘤小鼠骨髓造血細胞，減輕骨髓抑制，提升白細胞數(shù)量與骨髓造血細胞Notch信號通路相關(guān)基因和蛋白的分布及表達的關(guān)系，其關(guān)鍵機制可能是：對于CTX化療所致骨髓抑制，針灸可以通過上調(diào)荷瘤小鼠骨髓細胞中Notch信號通路上numb蛋白（nu