針灸對(duì)CTX化療荷瘤小鼠骨髓細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因調(diào)控的研究.pdf

1、目的：骨髓抑制主要表現(xiàn)為外周血中白細(xì)胞降低，是化療最常見(jiàn)的毒副反應(yīng)之一，進(jìn)而可引起身體機(jī)能狀態(tài)下降、抵抗力減弱、嚴(yán)重感染等嚴(yán)重不良反應(yīng)。根據(jù)我們前期已有的針灸抗骨髓抑制的研究基礎(chǔ)，本研究以與骨髓造血細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中影響造血干／祖細(xì)胞的生存、增殖和分化方向有關(guān)的Notch信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討Notch信號(hào)通路上相關(guān)差異基因與針灸改善化療后不良反應(yīng)，保護(hù)骨髓造血細(xì)胞、改善骨髓抑制、增加外周血白細(xì)胞的相關(guān)作用途徑及分子生物學(xué)機(jī)制；探討針刺與艾

2、灸兩種療法在改善骨髓抑制，提升白細(xì)胞方面作用環(huán)節(jié)的異同。同時(shí)這一研究也可為針灸改善造血損傷類疾病提供新的治療方法和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法：選用清潔級(jí)，雄性昆明種(KM)小鼠40只，體重18±2g，小鼠在實(shí)驗(yàn)室中自由飼養(yǎng)3天后進(jìn)行植瘤（溫度20o～25℃，相對(duì)濕度60％左右）。在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行操作，把所需物品放在無(wú)菌操作臺(tái)上紫外線燈照射30min。抽取生理鹽水13.8ml放入三角燒瓶中。左手持傳代鼠，右手對(duì)小鼠腹部碘伏消毒，用1m

3、l注射器（5ml針頭）抽取腹水2.3ml，緩慢注入含13.8ml的生理鹽水的三角燒瓶中，輕輕混勻，達(dá)到7倍稀釋液。用1ml注射器（5ml針頭）抽取細(xì)胞稀釋液1ml，左手持鼠，右手先對(duì)40只小鼠左腋下碘伏消毒，再持注射器進(jìn)行腋下注射，過(guò)程中針頭先刺入皮下，再緩慢向左腋下方向推進(jìn)，到達(dá)腋窩內(nèi)再緩慢注入用瘤細(xì)胞53106/0.2ml細(xì)胞稀釋液，隨后邊推針邊旋轉(zhuǎn)針頭至90°出針，同時(shí)用無(wú)菌棉簽按壓針孔數(shù)秒，避免液體滲出，最后放開(kāi)小鼠，手持其尾部

4、放入鼠籠中，完成植瘤。接種7天后，對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行尾靜脈采血并查WBC總數(shù)，挑選白細(xì)胞接近正常范圍，瘤體生長(zhǎng)良好的荷瘤小鼠32只（體質(zhì)量22±2g、瘤體直徑0.8cm左右），隨機(jī)分為4組，8只/組，即荷瘤空白組，荷瘤模型組，荷瘤針刺組，荷瘤艾灸組；分籠飼養(yǎng)，苦味酸對(duì)各組荷瘤小鼠進(jìn)行染色編號(hào)。荷瘤模型組，荷瘤針刺組，荷瘤艾灸組的小鼠1次性腹腔注射環(huán)磷酰胺（CTX）150mg/kg，停藥后4h模型即成，荷瘤空白組小鼠腹腔注入同等劑量的生理鹽水

5、。各組荷瘤小鼠每次選取1只依次配對(duì)固定于自制鼠板上施以針刺和艾灸治療。荷瘤空白組，荷瘤模型組陪同固定不治療；荷瘤針刺組選取“大椎”、“膈俞”（雙）、“腎俞”（雙）、“足三里”（雙）選用江蘇無(wú)錫佳健牌美容毫針（規(guī)格：0.19cm310mm，針柄20mm），采用管式進(jìn)針?lè)ㄖ贝蹋M(jìn)針深度為3mm，留針6min。每日1次，連續(xù)5天；荷瘤艾灸組選取“大椎”、“膈俞”（雙）、“腎俞”（雙）、“足三里”（雙）選用特制美容艾條（規(guī)格：0.4cm325c

6、m）點(diǎn)燃后，高于荷瘤小鼠穴位皮膚2cm處固定每穴懸灸3min，每日1次，連續(xù)5天。荷瘤空白組，荷瘤模型組同步固定，但不予治療。從荷瘤小鼠注射CTX之前一直到治療5天后，每天早上定時(shí)、按編號(hào)順序?qū)⒚恐恍∈蟾钗察o脈采血，光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)，治療5天后的第2天在干冰上取荷瘤小鼠雙側(cè)股骨和脛骨。課題組前期應(yīng)用小通量基因表達(dá)譜芯片初步篩選各組健康小鼠骨髓造血細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因；由于一方面健康小鼠與荷瘤小鼠為同一批次

7、，只是帶瘤體質(zhì)的不同，另一方面由于經(jīng)費(fèi)原因，故在前期篩選的基礎(chǔ)上，運(yùn)用免疫組化法對(duì)進(jìn)一步篩選不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因蛋白表達(dá)情況；Realtime-PCR法分析不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因mRNA的轉(zhuǎn)錄情況；Western–Blot法進(jìn)一步驗(yàn)證不同組別荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因的蛋白表達(dá)量。闡釋調(diào)控 CTX化療荷瘤小鼠骨髓細(xì)胞中的Notch信號(hào)

8、通路是針灸減輕骨髓抑制、提升外周血白細(xì)胞等綜合作用的關(guān)鍵機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　（1）“實(shí)驗(yàn)一”結(jié)果顯示，荷瘤小鼠從注射CTX后的第2天外周血白細(xì)胞即降低。與荷瘤空白組比，治療后第3天荷瘤模型組、荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞計(jì)數(shù)降至最低（P<0.05），治療后第4天開(kāi)始回升，與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)回升幅度較大。治療后第5天，荷瘤模型組、荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)均已接近基礎(chǔ)白細(xì)胞水平，且與荷瘤針刺

9、組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)高于荷瘤模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?。?）“實(shí)驗(yàn)二”結(jié)果顯示，通過(guò)小通量基因表達(dá)譜芯片對(duì)健康小鼠進(jìn)行初步篩選，由于考慮小鼠來(lái)至同一整體，只是帶瘤體質(zhì)不同，故沒(méi)有對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行再次篩選，把篩選出的七個(gè)差異基因：notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2同樣作為差異基因進(jìn)行下一步研究。
　　（3）“實(shí)驗(yàn)三”結(jié)果顯示，運(yùn)用免疫組化法對(duì)小通量基因表

10、達(dá)譜芯片初步篩選出的荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選，與荷瘤空白組比，荷瘤模型組中notch2和jag1、jag2蛋白表達(dá)含量降低，numb1和numb2蛋白表達(dá)含量升高，且具有顯著性差異（P<0.05）；Delta1、notch1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組與荷瘤艾灸組中notch2和jag1蛋白表達(dá)含量降低，numb1和numb2蛋白表達(dá)含量升高，且具有顯著性差異（P<

11、0.05）；Delta1、notch1、jag2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。故最后確定將具有顯著性差異的jag1、notch2、numb1、numb2基因進(jìn)一步進(jìn)行研究。
　?。?）“實(shí)驗(yàn)四”結(jié)果顯示，運(yùn)用RT-PCR法對(duì)荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號(hào)通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2的mRNA轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測(cè)。與荷瘤空白組比，荷瘤模型組 jag1、notch2蛋白表達(dá)含量升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)

12、學(xué)意義（P>0.05），numb1、numb2蛋白表達(dá)含量降低，且 numb2具有顯著性差異（P<0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組jag1、notch2蛋白表達(dá)含量均有升高，numb1蛋白表達(dá)含量降低，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤艾灸組 numb2蛋白表達(dá)含量升高，具有顯著性差異（P<0.05）；與荷瘤針刺組比，荷瘤艾灸組 numb2蛋白表達(dá)含量高于荷瘤針刺組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05

13、）。
　?。?）“實(shí)驗(yàn)五”結(jié)果顯示，運(yùn)用Western-blot法對(duì)荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號(hào)通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。與荷瘤空白組比，荷瘤模型組jag1、notch2蛋白表達(dá)含量升高且有顯著性差異（P<0.05），numb1、numb2蛋白表達(dá)含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與荷瘤模型組比，荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組jag1、notch2蛋白表達(dá)含

14、量均降低，且具有顯著性差異（P<0.05），numb1、numb2蛋白表達(dá)含量升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與荷瘤針刺組比，荷瘤艾灸組 jag1、notch2蛋白表達(dá)含量均降低，numb1、numb2蛋白表達(dá)含量升高，差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但針刺有優(yōu)于艾灸的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1.荷瘤小鼠白細(xì)胞基數(shù)比健康小鼠稍高。
　　2.針刺和艾灸可以減輕 CTX化療所致荷瘤小鼠骨髓抑制，提升外周血白細(xì)

15、胞，其療效確切與導(dǎo)師組前期研究結(jié)果一致，治療后第3天降至最低，第4天開(kāi)始回升，第5天達(dá)到正常，且荷瘤針刺組、荷瘤艾灸組白細(xì)胞數(shù)高于荷瘤模型組，針刺和艾灸兩種方法沒(méi)有顯著性差異。
　　3.課題組前期應(yīng)用小通量基因表達(dá)譜芯片初步篩選各組正常小鼠骨髓造血細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因；共篩選出七個(gè)差異基因：notch1、notch2、jag1、jag2、delta1、numb1、numb2。通過(guò)免疫組化法對(duì)小通量基因表達(dá)譜芯片初步

16、篩選出的荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號(hào)通路7個(gè)差異基因進(jìn)一步篩選，確定jag1、notch2、numb1、numb2基因具有顯著性差異。
　　4.通過(guò)對(duì)上述指標(biāo)的變化規(guī)律及相關(guān)性分析，闡釋針灸保護(hù)荷瘤小鼠骨髓造血細(xì)胞，減輕骨髓抑制，提升白細(xì)胞數(shù)量與骨髓造血細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白的分布及表達(dá)的關(guān)系，其關(guān)鍵機(jī)制可能是：對(duì)于CTX化療所致骨髓抑制，針灸可以通過(guò)上調(diào)荷瘤小鼠骨髓細(xì)胞中Notch信號(hào)通路上numb蛋白（nu