油茶查爾酮合酶和異構(gòu)酶基因cDNA的鑒定和序列分析.pdf

1、油茶為山茶屬多年生常綠喬木，是我國(guó)獨(dú)有的食用木本油料樹種，廣泛分布于湖南、江西、廣西等17個(gè)省(市、自治區(qū))，1100多個(gè)縣(市)。 黃酮類化合物系色原烷或色原酮的衍生物，是一類在高等植物中大量存在的重要的次生代謝產(chǎn)物。它們有很多重要的功能，例如，參與花色的形成、UV防護(hù)、抵抗病原體等等。目前研究表明，它們還與人類的健康有著密切的關(guān)系，具有消除氧自由基、抗炎、抗癌、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等多種藥理作用。查爾酮合成酶是所有黃酮類化合物合

2、成的關(guān)鍵酶，它介導(dǎo)了黃酮類化合物合成的第一步，催化3個(gè)分子的丙二酞輔酶A與1個(gè)分子對(duì)羥基苯丙烯酞輔酶A縮合成袖皮素查爾酮，并以此為支架經(jīng)由查爾酮異構(gòu)酶的異構(gòu)作用使其他黃酮類化合物得以衍生出來(lái)。 本項(xiàng)研究以近成熟油茶種子構(gòu)建的cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)，從中釣取經(jīng)EST數(shù)據(jù)初步分析并推斷可能是查爾酮合酶基因和查爾酮異構(gòu)酶基因的5條cDNA序列進(jìn)行研究，克隆號(hào)分別為1080、1279、4211、1216和1249。首先用微量堿裂解法提取5個(gè)

3、克隆的質(zhì)粒DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定。5個(gè)克隆均擴(kuò)增出特異譜帶，其中1216號(hào)克隆和1249號(hào)克隆的擴(kuò)增片斷為1000bp左右，初步判斷為查爾酮異構(gòu)酶基因序列；1080、1279和4211號(hào)克隆的推斷片斷大小依次為860bp、1030bp和1500bp左右，初步判斷為查爾酮合酶基因序列或片斷。 選擇4211號(hào)克隆和1216號(hào)克隆進(jìn)行完整序列的測(cè)序，結(jié)果顯示，4211號(hào)克隆cDNA全長(zhǎng)序列為1523bp，經(jīng)與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)

4、行比對(duì)分析，確定為查爾酮合酶基因；該基因編碼412個(gè)氨基酸，起始密碼子為GTG，終止密碼子為TAA，是個(gè)完整的CDS。經(jīng)網(wǎng)上比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該cDNA序列比核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中最長(zhǎng)的查爾酮合酶基因cDNA序列還要多69個(gè)堿基，是目前世界上發(fā)現(xiàn)的最長(zhǎng)的查爾酮合酶基因。1216克隆為查爾酮異構(gòu)酶基因的cDNA，拼接校對(duì)后的長(zhǎng)度為1002bp，編碼206個(gè)氨基酸，起始密碼子為GTG，終止密碼子為TAG，是查爾酮異構(gòu)酶基因的完整CDS。兩個(gè)基因克隆現(xiàn)保存在中