攀西金龍膽草種質(zhì)資源及其查爾酮合酶基因和β-香樹酯合酶基因的克隆研究.pdf

1、金龍膽草（Conyza blinii H.Lév.）是一種菊科白酒草屬植物，主要呈野生狀態(tài)，分布于四川攀西地區(qū)、云南中南部及貴州部分地區(qū)。其活性成分在慢性支氣管炎、胃潰瘍等疾病的治療上具有良好療效。多年來，金龍膽草的研究集中在化學(xué)成分種類和主要活性成分藥理藥效等方面，對其有效成分含量的研究卻鮮見報道，基于分子生物學(xué)層面的研究更屬于空白領(lǐng)域。
　　本研究廣泛收集了金龍膽草資源在主產(chǎn)區(qū)攀西地區(qū)的分布信息，對采集的樣品利用ICP-AES

2、手段進(jìn)行了無機(jī)元素含量檢測，利用紫外分光光度法進(jìn)行了總黃酮和總皂苷含量的檢測，利用高效液相色譜法進(jìn)行了蘆丁、槲皮素和苦蒿素含量的檢測;通過RAPD、SRAP和SCAR分子標(biāo)記對該區(qū)域內(nèi)野生金龍膽草居群間的遺傳多樣性進(jìn)行了研究;利用RACE技術(shù)克隆了金龍膽草黃酮代謝途徑的關(guān)鍵酶查爾酮合酶基因和三萜皂苷代謝途徑的關(guān)鍵酶β-香樹酯合酶基因。主要結(jié)果如下:
　　1.以攀西地區(qū)野生金龍膽草生長環(huán)境為背景，研究了金龍膽草的生長環(huán)境和植物形態(tài)，

3、發(fā)現(xiàn)金龍膽草在不同的生長時期植物形態(tài)變化較大。比較了野生和人工栽培植株葉片的超顯微結(jié)構(gòu)，掃描電鏡結(jié)果顯示，除人工栽培品種的葉片上偶可觀察到圓形氣孔外，兩類葉片的腺毛、非腺毛、表皮等的顯微差別并不大。
　　2.無機(jī)元素的含量檢測結(jié)果顯示，5個不同來源的金龍膽草均不含重金屬Cr和Cd，而Fe/Mn含量均較高，除Al元素顯示出涼山州樣品明顯較多外，其它元素在樣品間的含量較為相似。對16個不同來源的金龍膽草進(jìn)行了總黃酮和總皂苷含量的檢測，

4、總黃酮含量較高，在4.660％～7.530％之間;對花期植株花、葉、莖、根四個組織部位的黃酮成分蘆丁、槲皮素進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)蘆丁和槲皮素含量均為葉中最高，含量分別占總黃酮成分的0.478％和0.158％。三萜總皂苷的含量在0.566％～0.909％之間，且以葉中最高;二萜成分苦蒿素的含量在0.560％～1.185％之間，以葉中含量最高。
　　抗氧化實(shí)驗(yàn)顯示金龍膽草粗提物及分離純化的總皂苷對DPPH自由基和羥自由基均有較好的抑制作用

5、。以總黃酮、總皂苷和苦蒿素含量為指標(biāo)，將攀西16個來源的金龍膽草聚為四大類，聚類的結(jié)果顯示有效成分含量的相似性并不完全與其所處地理位置的遠(yuǎn)近相關(guān)，說明野生金龍膽草次生代謝物的產(chǎn)生不僅與地理位置有關(guān)，還可能與縱向海拔等生長地的小物候環(huán)境有關(guān)。
　　3.利用RAPD和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對16個不同來源地金龍膽草進(jìn)行了遺傳多樣性研究，15條RAPD引物和12對SRAP引物分別獲得140個和318個多態(tài)位點(diǎn)，平均相似系數(shù)分別為0.673

6、2和0.6804。合并的RAPD-SRAP標(biāo)記結(jié)合了兩種標(biāo)記的特點(diǎn)，得到平均遺傳相似性為0.6787，數(shù)據(jù)顯示金龍膽草在攀西地區(qū)遺傳多樣性并不豐富，這可能與該植物生長地較集中，區(qū)域內(nèi)能進(jìn)行基因交流的國土面積不大有關(guān)。RAPD-SRAP標(biāo)記將16個不同來源樣品聚為三類，聚類結(jié)果與地理位置十分相關(guān)，來自攀枝花市的樣品和涼山州的8、9樣被聚為Ⅰ類，涼山的10和11樣被聚為Ⅱ類，其余涼山州的樣品聚為第Ⅲ類，顯示了攀西地區(qū)野生金龍膽草居群間的親緣

7、關(guān)系與地理分布較高的關(guān)系。
　　RAPD轉(zhuǎn)化的SCAR標(biāo)記研究結(jié)果顯示，金龍膽草SCAR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，16個樣品的SCAR特異片段同源性較高(71.32％)。利用該標(biāo)記能快速明確地將金龍膽草與其易混淆植物艾草、木里白酒草和黃花蒿區(qū)分開來。著重研究了黃花蒿與金龍膽草的特異鑒別，結(jié)果顯示，理想狀態(tài)下黃花蒿藥材中僅含有5％金龍膽草時，SCAR標(biāo)記便能快速靈敏地鑒別出金龍膽草的蹤影。
　　4.本研究利用RACE技術(shù)從金龍膽草中克

8、隆得到黃酮途徑關(guān)鍵酶查爾酮合酶基因和三萜皂苷合成途徑β-香樹酯合酶基因，分別命名為CbCHS和CbβAS∶
　　CbCHS（GenBank登錄號KJ155749）包含有一個長為1197bp的開放閱讀框，編碼的蛋白序列與其它植物有高度的同源性，在第63位半胱氨酸密碼子內(nèi)第1位和第2位堿基之間、第294位甘氨酸密碼子內(nèi)第1位和第2位堿基之間分別含有1個415bp的內(nèi)含子和1個486bp大小的內(nèi)含子，這與植物查爾酮合酶家族普遍含有1個內(nèi)

9、含子情況的有所不同。CbCHS編碼的蛋白具有查爾酮合酶家族的特征多肽序列GVLFGFGPGL，和必需的活性位點(diǎn)Cys(C)167、His(H)306和Asn(N)339;半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示金龍膽草花期CbCHS表達(dá)量為莖＞葉＞花＞根。表達(dá)量與有效成分含量相關(guān)性分析顯示花器官中CHS的表達(dá)量與花青素相對含量，蘆丁、槲皮素含量有極顯著的正相關(guān)關(guān)系，r值均趨于1。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-CbCHS進(jìn)行原核表達(dá)分析，SDS-PAGE

10、檢測結(jié)果顯示誘導(dǎo)得到了43.5kD左右的融合蛋白，表明CbCHS基因在E.coli BL21中成功表達(dá)。
　　5.CbβAS（GenBank登錄號KJ650043）包含有一個長為2151bp的開放閱讀框，全長cDNA序列比對顯示其編碼的氨基酸與其它植物的βAS基因具有較高的同源性，序列包含該基因家族特有的DCTAE保守序列和QW保守序列。半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示金龍膽草花期CbβAS的表達(dá)量為葉＞莖＞花＞根，各個部位的三萜總