茯苓羊毛甾醇合酶基因PcLSS克隆及其功能驗(yàn)證.pdf

1、通常說的茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)除了藥用之外也可作為食用，可以與非常多的藥材配伍，屬于多孔菌科(Polyporaceae)的一種高等真菌。其主要功能成分為三萜和多糖類物質(zhì)，具有驅(qū)風(fēng)除濕、增強(qiáng)抵抗力、抗腫瘤、抗炎、安魂養(yǎng)神等多種藥理功能。
　　在生成膽甾醇類物質(zhì)的過程中，四環(huán)三萜類化合物羊毛甾醇是其中間體，由羊毛甾醇合酶(LSS)催化生成。該酶是一個很重要的酶。在真菌與植物的三萜類物質(zhì)代謝途徑中，它們有共

2、同的上游物質(zhì)基礎(chǔ)，而在茯苓中關(guān)于羊毛甾醇合酶的生物功能尚無詳細(xì)報(bào)到，本文正是利用這一點(diǎn)來驗(yàn)證該生物合成酶的功能。
　　采用分子生物學(xué)相關(guān)方法克隆出了茯苓中羊毛甾醇合酶基因(PcLSS)。通過羊毛甾醇合酶基因突變型釀酒酵母菌株異源互補(bǔ)系統(tǒng)驗(yàn)證其基因功能。通過冷休克表達(dá)系統(tǒng)研究了該酶蛋白表達(dá)及純化條件，同時研究了基因在不同生長天數(shù)的表達(dá)特性。主要研究結(jié)果如下:
　　1.成功克隆PcLSS基因利用分子生物學(xué)相關(guān)方法獲得PcLSS基

3、因CDS區(qū)2187bp(GeneBanK No:KR336544),gDNA5408bp(GeneBanK No:KR336543)。啟動子區(qū)含有與脫落酸、光、茉莉酸甲酯等多種與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄順式元件。PLSS由728個氨基酸組成分子量大小為83.4kDa的不穩(wěn)定親水性蛋白。通過分析PcLSS蛋白序列發(fā)現(xiàn)其與絲孔菌屬蛋白序列相似度較高，NJ進(jìn)化樹結(jié)果表明其物種所處的分類地位與蛋白的聚類結(jié)果相符合。
　　2.PcLSS基因能互補(bǔ)

4、酵母ERG7基因功能利用傳統(tǒng)雙酶切再連接的方法獲得pYES2-pclss質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至ERG7雜合二倍體釀酒酵母突變菌株YHR072W中。在四分體時期挑選出含目的基因的缺陷型單倍體菌株，將兩種缺陷型菌株劃線于YPG和YPG+麥角甾醇(ergosterol)培養(yǎng)基上，進(jìn)行表型分析，得到的展示結(jié)果符合菌株的生長特性，證明獲得的PcLSS基因在釀酒酵母中介導(dǎo)了麥角甾醇的生成，有LSS基因功能。
　　3.蛋白表達(dá)以及純化用雙酶切的方法構(gòu)建原

5、核表達(dá)所須的pColdI-pcLSS重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至E.coli菌株BL21(pG-KJE8)中進(jìn)行冷休克表達(dá)(15℃)，試驗(yàn)不同的蛋白表達(dá)條件，將最優(yōu)表達(dá)條件下獲得的目的蛋白過HIS純化柱純化進(jìn)而得到PcLSS蛋白。
　　4.PcLSS基因在菌絲生長到12天時，基因表達(dá)量達(dá)到最高利用qRT-PCR的方法比較了在28℃條件下菌絲生長到6、9、12、15、18天時基因的相對表達(dá)量，以CYP基因作為內(nèi)參基因，結(jié)果顯示當(dāng)菌絲生長到