PcG家族蛋白在神經(jīng)管畸形中的表達(dá)調(diào)控.pdf

1、研究背景：
　　 神經(jīng)管畸形（NTD）是一類發(fā)病率高且后果嚴(yán)重的先天畸形，受遺傳和環(huán)境交互作用的影響。孕婦葉酸缺乏是導(dǎo)致NTD的原因之一，但是在孕婦葉酸不缺乏的情況下，仍有一些因素可導(dǎo)致NTD發(fā)生。表觀遺傳修飾在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起了重要作用，PcGs（Polycomb groups）蛋白被認(rèn)為是其核心部分。目前，人們多關(guān)注PcG蛋白是通過影響下游基因參與細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育，卻很少有人報(bào)道上游哪些機(jī)制調(diào)控著PcG蛋白表達(dá)。Micro

2、RNAs（miRNAs）是一類與轉(zhuǎn)錄后基因沉默有關(guān)的小RNA分子。MiRNAs是否在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中能夠調(diào)節(jié)PcG蛋白的表達(dá)目前仍不清楚。此外，PcG蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，神經(jīng)上皮細(xì)胞凋亡過度，是導(dǎo)致神經(jīng)管閉合延遲，引發(fā)NTD。細(xì)胞凋亡是否與胎兒NTD發(fā)生直接相關(guān)目前仍不清楚。本研究從PcG蛋白的表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞凋亡兩個(gè)角度深入探討導(dǎo)致神經(jīng)管畸形發(fā)生的分子機(jī)制。
　　 研究目的：
　　 在母親葉酸不缺乏的

3、情況下，研究PcGs家族蛋白在神經(jīng)管畸形兒神經(jīng)和胎盤組織中的表達(dá)調(diào)控，探討神經(jīng)管畸形兒發(fā)育過程中神經(jīng)和胎盤組織中細(xì)胞凋亡的發(fā)生規(guī)律。
　　 研究方法：
　　 1.利用電化學(xué)發(fā)光法，檢測(cè)NTD組和對(duì)照母親血清葉酸水平。
　　 2.利用Western blot技術(shù)，檢測(cè)Polycomb家族核心蛋白EZH2，SUZ12，EED和BMI1在NTD兒和對(duì)照組兒神經(jīng)組織和胎盤組織中的表達(dá)。
　　 3.利用PicTar

4、，Targetscan和miRanda等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能調(diào)節(jié)表達(dá)異常的PcG蛋白-EED的microRNA（miRNA）。
　　 4.運(yùn)用TaqMan MicroRNA Arrays檢測(cè)預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)镋ED的miRNA在胎盤和神經(jīng)組織中的表達(dá)。
　　 5.利用RT-Realtime PCR、Western blot、雙熒光素酶活性分析等分子生物學(xué)方法驗(yàn)證miRNAs與EED的相互作用。
　　 6.利用原位末

5、端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）研究NTD組和對(duì)照組在胎盤組織和神經(jīng)組織中的細(xì)胞凋亡發(fā)生狀況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.NTD組和對(duì)照組母親血清葉酸水平均在正常范圍內(nèi)，且兩組之間無明顯差異（P=0.4464）。
　　 2.EZH2，SUZ12，BMI1，EED蛋白在NTD組和對(duì)照組的胎盤和神經(jīng)組織均有不同程度的表達(dá)。其中，發(fā)現(xiàn)EED蛋白在NTD組胎盤、大腦皮質(zhì)、脊髓組織中均存在差異表達(dá)，在NTD組的胎盤和脊髓組織中表

6、達(dá)明顯升高（P<0.05），在大腦皮質(zhì)中表達(dá)顯著降低（P<0.05）。
　　 3.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-30b，miR-30c and mi-R181b的靶基因可能為Eed，這些miRNAs與Eed的3'UTR互補(bǔ)的“seed”片段在不同物種間是高度保守的。
　　 4.miRNA與其靶基因存在反向調(diào)節(jié)關(guān)系，為了分析預(yù)測(cè)的miRNAs哪些可能調(diào)節(jié)EED的表達(dá)，TaqMan MicroRNA Arrays是被用來檢測(cè)miRN

7、A在胎盤和神經(jīng)組織中的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)miR-30b在脊髓組織和大腦皮質(zhì)，miR-30c胎盤組織及miR-181b在脊髓組織中與EED存在反向表達(dá)，提示了miR-30b，miR-30c和miR-181b均有可能調(diào)控EED的表達(dá)，其調(diào)控關(guān)系可能受組織特異性影響。
　　 5.雙熒光素酶活性分析顯示，miR-30b和miR-30c與包含“seed”片段PGL3-EED3'-UTR的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著降低酶活性，提示miR-30b和mi

8、R-30c的“seed”片段作用于Eed的3'-UTR區(qū)，Eed為miR-30b和miR-30c的靶基因。
　　 6.利用Western blot和Real Time PCR檢測(cè)過表達(dá)或敲低miR-30b，miR-30c或miR-181b后內(nèi)源性EED蛋白和mRNA水平的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，升高miR-30b或miR-30c，EED蛋白水平明顯下調(diào)（P<0.05）；降低miR-30b或miR-30c，EED蛋白水平明顯上調(diào)（P<0.05）

9、，其mRNA水平均沒有明顯變化。無論升高或降低mi-R181b，EED蛋白水平和mRNA水平均沒有明顯變化。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-30b和miR-30c均可調(diào)節(jié)EED的表達(dá)。
　　 7.在體研究胎盤和神經(jīng)組織中的細(xì)胞凋亡水平發(fā)現(xiàn)，在大腦皮質(zhì)NTD組的細(xì)胞凋亡指數(shù)低于對(duì)照組（p<0.05）；胎盤絨毛組織細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯大于正常胎盤絨毛組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)（p<0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 1、在非葉酸缺乏的

10、神經(jīng)管發(fā)育缺陷過程中，Polycomb家族蛋白表達(dá)分布具有組織特異性，且EED蛋白在胎盤和神經(jīng)組織中均存在差異表達(dá)。
　　 2、在非葉酸缺乏的神經(jīng)管發(fā)育缺陷過程中，miR-30b在NTD組神經(jīng)組織中差異表達(dá)，miR-30c在NTD胎盤組織中差異表達(dá)。
　　 3、首次證實(shí)EED是miR-30b和miR-30c的靶基因，且miR-30b和miR-30c可以調(diào)節(jié)內(nèi)源性EED的表達(dá)。
　　 4、在非葉酸缺乏的神經(jīng)管發(fā)育缺