高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形差異表達(dá)基因的篩選、鑒定及功能研究.pdf

1、神經(jīng)管形成是胚胎早期發(fā)育中的重要事件，是指從神經(jīng)板出現(xiàn)、卷折形成神經(jīng)褶到左右神經(jīng)褶在背側(cè)中線(xiàn)靠攏愈合形成神經(jīng)管的連續(xù)生物學(xué)過(guò)程。神經(jīng)管是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的原基，神經(jīng)管的發(fā)生和分化是腦和脊髓正常發(fā)育的前提。在神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中，多種環(huán)境致畸因素可對(duì)其產(chǎn)生影響，引發(fā)神經(jīng)管畸形(neuraltube defects，NTDs)。神經(jīng)管畸形是發(fā)生率最高、危害也最為嚴(yán)重的一類(lèi)先天畸形，不僅危及患兒的生命和健康，而且給社會(huì)和家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

2、 從上個(gè)世紀(jì)開(kāi)始，科學(xué)家開(kāi)始檢測(cè)誘發(fā)神經(jīng)管畸形的各種致畸因子，其中高溫是較常見(jiàn)且難以預(yù)防和避免的一種環(huán)境致畸因素。因此，探討高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生機(jī)理成為實(shí)驗(yàn)畸形學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，人們從細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平對(duì)高溫致神經(jīng)管畸形的機(jī)理進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)研究，觀(guān)察了高溫對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、粘著、類(lèi)聚、組織誘導(dǎo)和器官發(fā)生等方面的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管形成和分化過(guò)程中，某一或某些相關(guān)基因的特異表達(dá)或特異不表達(dá)、

3、上調(diào)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)管發(fā)育異常，引發(fā)神經(jīng)管畸形。高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，這其中有些基因上調(diào)表達(dá)，有些基因下調(diào)表達(dá)，而關(guān)于這些差異表達(dá)基因的系統(tǒng)研究至今仍未見(jiàn)報(bào)道 抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)是一種尋找差異表達(dá)基因的技術(shù)，可以克隆出與驅(qū)動(dòng)子相比在檢測(cè)子中特異表達(dá)和上調(diào)表達(dá)的基因。應(yīng)用抑制性消減雜交方法構(gòu)建的消減cDNA文庫(kù)具

4、有特異性和均等化兩大突 出優(yōu)點(diǎn)。在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形的雙向消減cDNA文庫(kù)，從中篩選到了高溫致神經(jīng)管畸形過(guò)程中上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的基因。通過(guò)序列測(cè)定和同源性比較對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，然后通過(guò)Northern雜交方法進(jìn)一步證實(shí)這些基因在高溫致神經(jīng)管畸形過(guò)程中的差異表達(dá)情況。隨后從這些差異表達(dá)基因中，挑選在胚胎發(fā)育中起重要作用的下調(diào)表達(dá)基因——Npml，對(duì)其功能進(jìn)行了體外研究

5、。 第一部分高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定 為篩選高溫致神經(jīng)管畸形過(guò)程中的差異表達(dá)基因，我們首先構(gòu)建了高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫(kù)。實(shí)驗(yàn)中，我們分別提取高溫組和對(duì)照組金黃地鼠胚胎神經(jīng)管組織總RNA，通過(guò)SMART<'Tm>cDNA合成的方法反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA(ds eDNA)。將酚氯仿純化后的ds cDNA用RsaI消化，消化后的dscDNA再次經(jīng)酚氯仿純化，并用雙蒸水調(diào)

6、整濃度至300 ng/μl。取純化后的ds cDNA用于抑制性消減雜交。按PCR-select<'TM> cDNA subtraction kit說(shuō)明進(jìn)行正反兩個(gè)方向的消減雜交。以高溫組ds cDNA做檢測(cè)子、對(duì)照組ds cDNA做驅(qū)動(dòng)子進(jìn)行消減雜交，構(gòu)建高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形正向消減cDNA文庫(kù)，可從中篩選高溫致神經(jīng)管畸形過(guò)程中上調(diào)表達(dá)的基因。反之，以對(duì)照組ds cDNA做檢測(cè)子、高溫組ds cDNA做驅(qū)動(dòng)子進(jìn)行消減雜交，構(gòu)建高溫致

7、金黃地鼠神經(jīng)管畸形反向消減cDNA文庫(kù)，可從中篩選高溫致神經(jīng)管畸形過(guò)程中下調(diào)表達(dá)的基因。將看家基因Gapdh設(shè)立為消減雜交實(shí)驗(yàn)的對(duì)照以檢測(cè)消減效率。結(jié)果，Gapdh的表達(dá)豐度在消減雜交結(jié)束后明顯降低，表明我們的消減效率很高。將消減雜交得到的產(chǎn)物純化，然后通過(guò)T-A克隆的方法將其與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，鋪含氨芐青霉素的LB/X-gal/IPTG平板，構(gòu)建消減cDNA文庫(kù)。經(jīng)藍(lán)白斑初步篩選后，再利用菌落PCR方法進(jìn)一步鑒定

8、。結(jié)果顯示，構(gòu)建的消減cDNA文庫(kù)中包含150 bp-1 kb的長(zhǎng)短不一的差異表達(dá)基因片段。這說(shuō)明我們構(gòu)建的高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫(kù)是成功的，可用于篩選差異表達(dá)基因。 第二部分高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形差異表達(dá)基因的篩選、序列分析及鑒定 由于消減cDNA文庫(kù)中包含的基因信息較多，一般采用隨機(jī)法挑選文庫(kù)中的克隆進(jìn)行測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)中，我們選取經(jīng)菌落PCR證實(shí)插入片段較長(zhǎng)的克隆進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果通過(guò)blas

9、tn軟件與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析。在高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形反向消減cDNA文庫(kù)中，我們共篩選到14個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，經(jīng)分析均與已知基因有較高的同源性。這些基因編碼的蛋白有核糖體蛋白，參與代謝的酶，翻譯及轉(zhuǎn)錄因子和其他。隨后通過(guò)Northern雜交證實(shí)了這些基因在高溫致畸胚胎神經(jīng)管中表達(dá)水平均明顯降低。而在高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形正向消減eDNA文庫(kù)中，由于擴(kuò)增得到的片段普遍較短，測(cè)序和同源性分析后僅發(fā)現(xiàn)

10、了一個(gè)有意義的差異表達(dá)基因片段。此片段與小鼠磷酸甘油酸酯激酶(Pgkl)同源且同源性高達(dá)92﹪。Northern雜交證實(shí)該基因在高溫致畸胚胎神經(jīng)管中表達(dá)水平明顯升高。從高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫(kù)中篩選得到的基因，它們的差異表達(dá)情況均得到Northern雜交驗(yàn)證，證實(shí)這些基因在高溫致神經(jīng)管畸形過(guò)程中的表達(dá)發(fā)生了異常變化，同時(shí)也說(shuō)明這些基因的差異表達(dá)與高溫致神經(jīng)管畸形的發(fā)生密切相關(guān)。 第三部分Npml基因功能的體外

11、研究 Npml(nucleophosmin)是我們從高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形反向消減eDNA文庫(kù)中篩選到的一個(gè)基因。以往的研究顯示，Npml在胚胎發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色。Npml<'-/->的小鼠胚胎較正常胚胎發(fā)育遲緩，前腦發(fā)育缺陷，眼睛缺失。說(shuō)明Npml對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育是必需的。因此我們對(duì)Npml在高溫致畸中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。由于在高溫致神經(jīng)管畸形過(guò)程中Npml基因呈下調(diào)表達(dá)，我們?cè)谏窠?jīng)干細(xì)胞(neural s

12、tem cells，NSCs)的體外培養(yǎng)中，應(yīng)用RNA干擾(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，對(duì)該基因的功能進(jìn)行了比較深入的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RNAi技術(shù)成功地在mRNA和蛋白水平上降低了Npml的表達(dá)，干擾效果得到了RT-PCR和Western blot證實(shí)。隨后我們從細(xì)胞增殖、凋亡和分化三個(gè)方面著手，研究Npml基因表達(dá)降低對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，Npml基因表達(dá)降低后，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，凋亡的發(fā)生

13、率明顯增加，而神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的比例未受到影響。此外，Npml基因表達(dá)降低后，p53蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明Npml基因干擾后引發(fā)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡與p53信號(hào)通路密切相關(guān)。 本項(xiàng)研究成功地構(gòu)建了高溫致金黃地鼠神經(jīng)管畸形雙向消減cDNA文庫(kù)，并從中篩選到了與高溫致神經(jīng)管畸形密切相關(guān)的下調(diào)表達(dá)基因和上調(diào)表達(dá)基因；還以體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞為研究模型，用RNAi技術(shù)，對(duì)在胚胎發(fā)育中起重要作用的下調(diào)表達(dá)基因Npm1在高溫