培美曲塞誘導(dǎo)神經(jīng)管畸形動物模型及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究目的：本研究利用抗葉酸代謝藥培美曲塞（PMX）對C57BL/6J孕鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，通過對孕鼠胚胎形態(tài)學(xué)觀察及其他指標(biāo)的檢測，篩選出最佳的給藥劑量和時間，建立葉酸代謝障礙的C57BL/6J小鼠胚胎神經(jīng)管畸形(neuraltubedefects，NTDs)動物模型；采用微陣列比較基因組雜交技術(shù)(aCGH)檢測PMX誘導(dǎo)NTDs模型基因組拷貝數(shù)變異；應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測PMX誘導(dǎo)NTDs模型的基因表達(dá)譜,篩選可能的PMX引起NT

2、Ds的致病基因；初步探討PMX對NTDs發(fā)生發(fā)展的影響及相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究。
　　研究方法：本研究中將7～8周健康雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分兩組受孕，給藥實驗組于孕7.5（E7.5）天腹腔注射PMX，摸索適當(dāng)?shù)慕o藥劑量并建立神經(jīng)管畸形動物模型，正常對照組按體重注射同等劑量的生理鹽水。在孕11.5（E11.5）天，頸椎離斷處死實驗組和正常對照組孕鼠，取胚胎于在解剖顯微鏡下觀察胚胎神經(jīng)管畸形的外部特征；經(jīng)固定、切片、染色后，光鏡下

3、觀察畸胎情況及神經(jīng)管形態(tài)改變；高效液相色譜法首先測定PMX干預(yù)孕鼠的不同時間點的葉酸及代謝產(chǎn)物水平；ELISA方法檢測PMX誘導(dǎo)的E7.5天胚胎組織葉酸水平；測定胚胎組織的二氫葉酸還原酶（DHFR）活性；RT-PCR法檢測胚胎組織葉酸代謝途徑關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平。應(yīng)用高分辨微陣列比較基因組雜交技術(shù)檢測PMX誘導(dǎo)小鼠NTDs模型基因組拷貝數(shù)變異，經(jīng)過生物信息學(xué)UCSC比對并應(yīng)用RT-PCR分析；應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)高通量篩選出在NT

4、Ds小鼠胚胎中異常表達(dá)的基因，并對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，對所篩選出的Ptch1基因、Endog基因進(jìn)行RT-PCR方法進(jìn)行驗證。體外實驗檢測PMX對小鼠胚胎干細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷；應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳方法檢測PMX對小鼠胚胎干細(xì)胞的DNA損傷的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.PMX具有明顯的胚胎致畸性，可導(dǎo)致孕鼠子宮明顯充血、淤血，大體外觀可見吸收胎、胎鼠發(fā)育遲緩及NTDs形態(tài)表現(xiàn)，HE染色可見NTDs胎鼠后腦泡未閉合。<

5、br>　　2.E7.5天注射PMX后，在4、12小時孕鼠血中葉酸明顯高于正常，24、96h接近于正常水平；5-FoTHF變化不大，5-MeTHF,,SAM,SAH四個指標(biāo)表現(xiàn)不同程度的降低，在24h開始慢慢恢復(fù)，但96h仍低于正常水平，具有統(tǒng)計學(xué)意義p＜0.05。，同時PMX明顯降低實驗組的胚胎組織葉酸水平。DHFR活性在4～8小時后降到最低，僅為正常小鼠胚胎組織的15％，隨后DHFR的活性開始恢復(fù)，但是在PMX注射24小時后，DHFR

6、活性仍然低于正常水平。實驗組小鼠胚胎組織結(jié)果顯示實驗組小鼠胚胎組織亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和腺苷酸合酶（TS）的mRNA表達(dá)水平低于對照組小鼠胚胎組織（p<0.05）。
　　3.應(yīng)用高分辨微陣列比較基因組雜交技術(shù)（Arraycomparativegenomichybridization,aCGH）對NTDs小鼠胚胎基因組拷貝數(shù)變異（Copynumbervariations,CNVs）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示共篩選出313個拷貝

7、數(shù)變異片段，包含101個變異基因。在表達(dá)譜中篩選出的差異表達(dá)基因共165個，表達(dá)上調(diào)的基因有96個，表達(dá)下調(diào)的基因有69個。這些與正常組織表達(dá)有差異基因包括代謝相關(guān)基因；發(fā)育相關(guān)基因；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因；轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因；物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因；應(yīng)激相關(guān)基因；離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因；細(xì)胞凋亡相關(guān)基因；細(xì)胞增殖相關(guān)基因；細(xì)胞分化相關(guān)基因；細(xì)胞粘附相關(guān)基因；細(xì)胞周期相關(guān)基因等。其中RT-PCR驗證結(jié)果與表達(dá)譜芯片結(jié)果一致（p<0.05）。
　　4.單細(xì)

8、胞凝膠電泳結(jié)果顯示PMX對小鼠胚胎干細(xì)胞DNA有損傷，并且有劑量依賴性。隨著PMX濃度的增加，DNA拖尾越明顯；同時造成小鼠胚胎干細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
　　結(jié)論：
　　1.PMX能成功的誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠胚胎NTDs，是一種接近人類的NTDs的動物模型。
　　2.抗葉酸代謝藥PMX可以抑制小鼠葉酸及其相關(guān)產(chǎn)物的代謝，NTDs胚胎發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異。
　　3.Ptch1基因的上調(diào)和Endog基因表達(dá)的下調(diào)在