低出生體重仔鼠骨骼肌PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑變化機(jī)制及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的研究.pdf

1、胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction,FGR)包括宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩(IUGR)和低出生體重(LBW)，是造成圍產(chǎn)兒死亡和發(fā)病的重要原因之一。代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是以中心性肥胖、糖尿病或糖調(diào)節(jié)受損、高血壓、血脂異常等多種代謝性疾病合并出現(xiàn)為臨床特點(diǎn)的一組癥候群。這些常見的慢性疾患嚴(yán)重影響了個(gè)人的生活質(zhì)量。隨著流行病學(xué)調(diào)查深入，發(fā)現(xiàn)低出生體重是成年后發(fā)生MS的高危因素。因而研究低出生

2、體重引起成年后MS的機(jī)制，以及實(shí)施成年期疾病的早期防治已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。出于醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的考慮，不能直接在人體上進(jìn)行試驗(yàn)，因此必須制造合適的低出生體重動(dòng)物模型用于實(shí)驗(yàn)研究。胎源假說、營(yíng)養(yǎng)程序化和代謝程序化等理論的提出為孕期低蛋白飲食法建立低出生體重仔鼠模型提供了理論基礎(chǔ)。 胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是MS發(fā)生的共同病理生理機(jī)制。在胰島素的靶器官中，胰島素抵抗最先在骨骼肌中表現(xiàn)出來，骨骼肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的異

3、常也將影響其功能的發(fā)揮。胰島素發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用必須通過胰島素受體底物蛋白激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3 kinase,PI3K)途徑。該途徑中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都將引起胰島素信號(hào)傳導(dǎo)減弱或受阻，導(dǎo)致胰島素抵抗形成，影響其調(diào)節(jié)糖代謝等生理效應(yīng)的發(fā)揮。在低出生體重人群和動(dòng)物中，有少數(shù)研究報(bào)道了某個(gè)年齡段的個(gè)別傳導(dǎo)因子的變化情況，目前尚缺乏生長(zhǎng)發(fā)育過程中PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑中各重要因子的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律以及

4、在胰島素抵抗發(fā)生中的作用的研究。 血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)是腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的關(guān)鍵產(chǎn)物。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已證實(shí)Ang Ⅱ與胰島素抵抗存在相關(guān)性，Ang Ⅱ?qū)σ葝u素PI3K.信號(hào)途徑具有多位點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用：抑制IRS-1的磷酸化、PI3K的激活、PKB的磷酸化以及GLUT4的轉(zhuǎn)位等，導(dǎo)致胰島素抵抗。有報(bào)道在低出生體重存在RAS活性的增強(qiáng)、AngⅡ含量增加。那么是否存在AngⅡ表達(dá)和作用

5、的增強(qiáng)，從而抑制低出生體重的PI3K傳導(dǎo)途徑，形成外周胰島素抵抗，削弱胰島素的各種代謝調(diào)節(jié)作用呢?目前尚不清楚。 營(yíng)養(yǎng)素是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，它可通過控制代謝產(chǎn)物或代謝狀態(tài)導(dǎo)致mRNA、蛋白質(zhì)合成與功能改變?！盃I(yíng)養(yǎng)程序化”概念指出，在發(fā)育的關(guān)鍵或敏感時(shí)期，營(yíng)養(yǎng)狀況將對(duì)機(jī)體或各器官功能產(chǎn)生長(zhǎng)期、以至終生的影響。故可以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)素改變發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期低出生體重人群或動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況來改變胰島素靶器官的結(jié)構(gòu)和功能，達(dá)到預(yù)防胰島素抵抗、降低

6、成年期MS的發(fā)生。精氨酸是一種條件必需氨基酸，在生物體內(nèi)有生理作用的是左旋精氨酸(L-arginine,L-Arg)，發(fā)揮著廣泛而重要的生理和藥理作用：可以治療FGR、促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育；能保護(hù)胰腺內(nèi)分泌功能、改善外周胰島素抵抗；能抑制心血管組織局部的RAS、減少AngⅡ含量等等。而在低出生體重補(bǔ)充L-Arg，是否可以通過抑制RAS活性、減低AngⅡ的含量和作用，從而改善胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，減輕或防止發(fā)生胰島素抵抗，達(dá)到預(yù)防成年期MS的目的呢

7、?這一推測(cè)還有待證實(shí)。 目的： (1)本實(shí)驗(yàn)給予孕鼠10％低蛋白飲食，觀察所生仔鼠數(shù)目、平均體重、IUGR發(fā)生率及圍產(chǎn)期死亡率，并觀察低出生體重仔鼠自幼年至成年期體重、血糖、血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)等的變化。 (2)在低出生體重仔鼠模型上觀察發(fā)育不同時(shí)期骨骼肌的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；研究生長(zhǎng)發(fā)育過程中PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要因子的動(dòng)態(tài)變化及在胰島素抵抗發(fā)生中的作用。 (3)觀察低出生體重仔鼠發(fā)育過程中An

8、g Ⅱ的表達(dá)和作用情況，并分析其與PI3K信號(hào)途徑因子的變化關(guān)系，揭示低出生體重仔鼠發(fā)生胰島素抵抗的機(jī)制。 (4)在低出生體重仔鼠生命早期補(bǔ)充L-Arg，觀察對(duì)仔鼠體重、血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)的影響，對(duì)骨骼肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以及對(duì)骨骼肌PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要因子表達(dá)和功能的影響。并分析L-Arg干預(yù)下AngⅡ的表達(dá)和作用變化，探討L-Arg防治胰島素抵抗的可能機(jī)制。 方法： (1)低出生體重仔鼠模型

9、的建立和實(shí)驗(yàn)分組：采用健康三月齡SD二級(jí)雌性和雄性大鼠各18只。按照雌雄1:1的比例同一籠中交配，次日清晨檢測(cè)出陰栓者定為受孕成功，按隨機(jī)數(shù)字表法分配進(jìn)入實(shí)驗(yàn)分組。孕期給予模型組、干預(yù)組孕鼠10％低蛋白飼料制造低出生體重仔鼠模型，給予正常組孕鼠21％正常蛋白飼料喂養(yǎng)。仔鼠生后21天的哺乳期內(nèi)，給予正常組和模型組母鼠自由飲水，給予干預(yù)組母鼠富含L-Arg的飲用水喂養(yǎng)。哺乳期母鼠均給予正常蛋白飼料，斷乳后仔鼠給予正常蛋白飼料喂養(yǎng)。分別測(cè)定7

10、d，21d，2m，3m齡仔鼠體重、血糖、血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)等。 (2)骨骼肌形態(tài)結(jié)構(gòu)、PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑因子、Ang Ⅱ的檢測(cè)：留取7d、21d、2m齡正常組、模型組仔鼠骨骼肌標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查和透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)分析；提取骨骼肌組織總蛋白，用Westemblot方法檢測(cè)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑重要因子PI3K、PKB和胰島素刺激前p-PKB、總GLUT4蛋白的表達(dá)；給予胰島素刺激骨骼肌后，提取總蛋白，用Western

11、 blot方法檢測(cè)p-PKB蛋白表達(dá)，提取細(xì)胞膜蛋白，用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞膜GLUT4的蛋白表達(dá)；用放射免疫法檢測(cè)骨骼肌中Ang Ⅱ的濃度、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)骨骼肌中AT1R的表達(dá)。 (3)L-Arg干預(yù)后相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)：于7d、21d、2m齡留取干預(yù)組仔鼠稱體重、取血和骨骼肌標(biāo)本。測(cè)定血糖、血清胰島素值，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。骨骼肌標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查和透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)分析；提取骨骼肌組織蛋白，用Western

12、 blot方法檢測(cè)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑重要因子PI3K、PKB、p-PKB和總GLUT4蛋白的表達(dá)；給予胰島素刺激后，分別提取骨骼肌總蛋白和細(xì)胞膜蛋白，用Westernblot方法分別檢測(cè)p-PKB和細(xì)胞膜GLUT4的蛋白表達(dá)；用放射免疫法檢測(cè)骨骼肌中Ang Ⅱ的濃度、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)骨骼肌AT1R的表達(dá)。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)、多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-wayA

13、NOVA)的SNK檢驗(yàn)或最小顯著差異(LSD)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料兩樣本比較用卡方檢驗(yàn)，參數(shù)間相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異具有顯著性。 結(jié)果： (1)模型組、干預(yù)組仔鼠平均出生體重明顯低于正常組(P=0.000，0.000)，達(dá)IUGR標(biāo)準(zhǔn)，而每窩產(chǎn)仔數(shù)和圍生期死亡率無明顯差異(P=0.946，P=0.158)。 (2)7d齡時(shí)，模型組、干預(yù)組仔鼠體重均低于正常組(P=0.000，0.000)，但干

14、預(yù)組高于模型組(P=0.029)；21d齡時(shí)，干預(yù)組體重高于模型組(P=0.036)，達(dá)正常水平(P=0.956)；2m齡時(shí)，模型組、干預(yù)組仔鼠體重均明顯低于正常組(P=0.001，0.044)，干預(yù)組體重較模型組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3m齡時(shí)，模型組與正常組體重比較無明顯差異(P=0.097)。7d、21d、2m齡時(shí)，三組仔鼠血糖、血清胰島素和胰島素抵抗指數(shù)均無顯著差別；3m齡時(shí)，模型組仔鼠血糖較正常組高，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.

15、170)。 (3)自7d至2m齡，模型組仔鼠骨骼肌纖維有明顯萎縮、排列稀疏紊亂，干預(yù)組骨骼肌纖維排列較模型組整齊、緊密；2m齡時(shí)模型組仔鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)明顯異常，肌原纖維排列紊亂、松散，部分萎縮、斷裂，大部分線粒體腫脹、嵴斷裂、空泡化。干預(yù)組肌原纖維排列較緊密，少部分線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化。 (4)7d齡時(shí)干預(yù)組仔鼠骨骼肌PI3K的蛋白表達(dá)開始高于模型組，至21d齡時(shí)干預(yù)組已接近正常組，2m齡時(shí)模型組明顯低于正常組，干預(yù)

16、組與正常組、模型組比較均無顯著差異；各時(shí)間點(diǎn)三組間仔鼠骨骼肌PKB的蛋白表達(dá)均未見顯著差別；7d時(shí)三組仔鼠骨骼肌胰島素刺激前p-PKB的蛋白表達(dá)無明顯差別，21d、2m齡時(shí)模型組明顯高于正常組和干預(yù)組)，而干預(yù)組與正常組比較無差異；給予胰島素刺激后，7d齡干預(yù)組p-PKB上升幅度低于正常組、高于模型組，但差異尚不顯著，21d齡時(shí)干預(yù)組p-PKB上升幅度達(dá)到正常組水平，2m齡時(shí)干預(yù)組顯著高于模型組，但低于正常組；三組仔鼠各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總GL

17、UT4的蛋白表達(dá)未見明顯差異，而經(jīng)胰島素刺激后干預(yù)組細(xì)胞膜GLUT4的蛋白表達(dá)在7d、21d、2m齡時(shí)均較模型組高，與正常組相當(dāng)。 (5)各時(shí)間點(diǎn)干預(yù)組仔鼠骨骼肌AngⅡ濃度均較模型組明顯減低，且與正常組比較無明顯差異；干預(yù)組骨骼肌AT1R表達(dá)較模型組弱、接近正常組。相關(guān)性分析顯示AngⅡ濃度與胰島素刺激下p-PKB上升幅度、細(xì)胞膜GLUT4表達(dá)成負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： (1)低出生體重仔鼠在2m至3m齡出現(xiàn)了生長(zhǎng)追趕