PI3Kγ在小鼠血管損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　(1)血管損傷所致的血管疾患目前是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的疾病之一。近來研究發(fā)現(xiàn)PI3Kγ在炎癥、氧化應(yīng)激、心血管疾病及組織損傷、修復(fù)中起重要作用。本研究旨在探討PI3Kγ在小鼠血管損傷中的作用及機(jī)制。
　　(2)越來越多的證據(jù)表明血小板參與血管炎癥的發(fā)生發(fā)展，本研究旨在探討血小板PI3Kγ在血管損傷中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　(1)在小鼠頸動脈結(jié)扎模型基礎(chǔ)上比較野生型(WT)及PI3Kγ

2、基因敲除小鼠血管損傷反應(yīng)。采用病理形態(tài)學(xué)分析新生內(nèi)膜形成情況，并用免疫熒光及免疫組化法檢測損傷血管炎癥細(xì)胞浸潤及NF-κB表達(dá)，RT-PCR檢測炎癥介質(zhì)的表達(dá)，DHE染色檢測血管壁活性氧生成。體外實驗中采用MMT法及細(xì)胞劃痕實驗、transwell小室遷移法比較野生型PI3Kγ基因敲除血管平滑肌平滑肌細(xì)胞增殖及遷移。
　　(2)在小鼠頸動脈部分結(jié)扎模型上反復(fù)靜脈注射活化的血小板。采用病理形態(tài)學(xué)分析頸動脈中膜-內(nèi)膜厚度，免疫熒光法檢

3、測血管炎癥細(xì)胞浸潤，明膠酶譜法檢測受損血管局部MMP-9的活性，實時熒光定量PCR檢測損傷血管局部炎癥介質(zhì)包括炎癥因子(TNF-α、IL-6)及粘附分子(VCAM-1，ICAM-1)的表達(dá)，DHE染色檢測血管壁活性氧生成。體外實驗中采用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板表面分子表達(dá)、活性氧生成、血小板白細(xì)胞聚集物形成，western blot檢測血小板Akt及p-38表達(dá)及活化，血小板、內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)檢測血小板-白細(xì)胞相互作用。
　　結(jié)果:

4、r>　　(1)血管損傷后3天、7天白細(xì)胞浸潤明顯，其中第3天以中性粒細(xì)胞為主，第七天以單核巨噬細(xì)胞為主，而PI3Kγ基因敲除小鼠損傷血管局部炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減少;PI3Kγ基因敲除小鼠損傷血管局部的細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)及粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)及NF-κB表達(dá)減少。
　　(2)血管損傷后PI3Kγ基因敲除小鼠活性氧的生成較WT小鼠明顯降低。
　　(3)血管損傷后PI3Kγ基因敲除小鼠新生內(nèi)膜形成較

5、WT小鼠明顯減少，血管平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜的增殖遷移減少;體外實驗顯示PI3Kγ-/-血管平滑肌增殖及遷移能力降低。
　　(4)頸動脈部分結(jié)扎模型顯示小鼠反復(fù)注射ADP活化的血小板后血管內(nèi)膜-中膜增厚血管重塑明顯，而注射PI3Kγ-/-血小板后此作用明顯減弱。
　　(5) WT血小板注射小鼠損傷血管的炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)表達(dá)、MMP-9活性及活性氧生成明顯增多;而PI3Kγ-/-血小板注射小鼠血管炎癥細(xì)胞浸潤、炎癥介質(zhì)表達(dá)、M

6、MP-9活性及活性氧生成增多不明顯。
　　(6)體外實驗研究發(fā)現(xiàn)ADP不能誘導(dǎo)PI3Kγ-/-血小板Akt、p-38活化，不能誘導(dǎo)PI3Kγ-/-血小板活化。
　　(7) ADP不能誘導(dǎo)PI3Kγ-/-血小板NADPH酶活化及活性氧生成。
　　(8) ADP誘導(dǎo)的血小板-白細(xì)胞聚集物形成及血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附中PI3Kγ/-血小板較WT血小板明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　(1) PI3Kγ介導(dǎo)血管損傷后的炎癥