PI3K通路介導的神經(jīng)炎癥參與高血壓交感亢進的作用研究.pdf

1、[研究背景和目的]
　　原發(fā)性高血壓病是以血壓升高為主要特征的慢性疾病，根據(jù)《中國高血壓基層管理指南(2014年修訂版)》提供數(shù)據(jù)表明中國約有三分之一的成人患有高血壓疾病。因此，揭示高血壓病的發(fā)病機制對高血壓的防治尤為重要。有研究證實炎癥參與了神經(jīng)源性高血壓的發(fā)生發(fā)展。血壓正常的大鼠通過腹腔注射低脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導全身性輕度炎癥可以顯著升高血壓，但在RAG-1-/-導致T細胞和B細胞缺乏無法

2、產(chǎn)生免疫炎癥反應的小鼠中，可以顯著改善由血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)或醋酸去氧皮質(zhì)酮誘導的高血壓和血管功能異常。有研究報道在高血壓患者和動物外周循環(huán)系統(tǒng)中存在輕度炎癥反應，以上證據(jù)提示炎癥參與了原發(fā)性高血壓病的發(fā)生發(fā)展。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也存在免疫炎癥反應，稱之為神經(jīng)炎癥(neuroinflammation)，主要以小膠質(zhì)細胞激活導致促炎細胞因子產(chǎn)生增加為特征。有研究報道正常血壓大鼠心血管調(diào)節(jié)核團下丘腦室旁核(Par

3、aventricular nucleus，PVN)微量注射促炎細胞因子白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）或腫瘤壞死因子(Tumornecrosis factor-α，TNF-α)可以引起血壓和大鼠腎交感神經(jīng)活動(Renal sympatheticnerve activity，RSNA)增加。另外，激活腦小膠質(zhì)細胞可以延長腦室內(nèi)注射AngⅡ引起的升壓效應。延髓頭端腹外側(cè)區(qū)(rostral ventrolateral m

4、edulla，RVLM)是交感神經(jīng)調(diào)控的關鍵中樞，在維持基礎血壓保持交感神經(jīng)緊張性中具有重要作用。腹腔注射LPS誘導的全身炎癥可導致RVLM內(nèi)神經(jīng)炎癥產(chǎn)生，從而參與了血壓升高和交感神經(jīng)活動亢進等病理改變。因此，探究神經(jīng)炎癥在高血壓心血管功能中樞調(diào)節(jié)中的作用和意義尤為重要，并為尋找高血壓防治的新策略提供新的思路。
　　腎素血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)過度激活在高血壓的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要

5、作用。在離體培養(yǎng)細胞和在體模型中，AngⅡ可以激活靜止的小膠質(zhì)細胞導致促炎細胞因子的產(chǎn)生。最近的證據(jù)表明AngⅡ的1型受體(AngiotensinⅡ type1 receptor，AT1R)阻斷劑-坎地沙坦阻斷AT1R可以減弱LPS誘導的中樞炎癥反應。因此，上述研究提示AngⅡ誘導的神經(jīng)炎癥參與了高血壓交感輸出增強機制。已有研究證實血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(Angiotensin-converting enzyme2，ACE2)在拮抗過度激活

6、的RAS中發(fā)揮著重要的補償機制，ACE2將AngⅡ和血管緊張素Ⅰ(AngiotensinⅠ，AngⅠ)轉(zhuǎn)化成血管緊張素-1-7[Angiotensin-1-7，Ang-(1-7)]，而Ang-(1-7)通過與Mas受體相結(jié)合發(fā)揮與AngⅡ相拮抗的生物學效應。ACE2/Ang-(1-7)/MasR軸主要通過增加一氧化氮的合成減少ROS生成發(fā)揮其心血管保護效應（如舒張血管、抗肥厚性心肌病等）。在心血管神經(jīng)調(diào)節(jié)區(qū)域特異性過表達ACE2能降低高

7、血壓大鼠血壓水平和交感神經(jīng)活動，并改善慢性心衰大鼠的壓力反射功能。有趣的是，有研究報道Ang-(1-7)對離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞發(fā)揮抗炎效應。證據(jù)表明心血管調(diào)節(jié)中樞RVLM內(nèi)磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphoinositide-3 kinase，PI3K）通路參與了血壓和中樞交感輸出的調(diào)節(jié)。在高血壓大鼠RVLM中PI3K通路明顯上調(diào)，其失活導致RVLM內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生減少，改善高血

8、壓心血管功能。而本課題組之前發(fā)現(xiàn)在RVLM干擾PI3K-p110δ亞基的表達導致中樞抗高血壓效應，而且PI3K通路也被證實參與了損傷和感染引起的外周的一些炎癥反應。因此，本研究的主要研究目標是明確RVLM內(nèi)PI3K通路在高血壓神經(jīng)炎癥中發(fā)揮的作用，并探索異常的RAS對高血壓神經(jīng)炎癥的影響是否與PI3K通路有關。
　　根據(jù)上述背景，本研究主要為了明確:1）在高血壓大鼠RVLM中干擾PI3K基因表達能否抑制神經(jīng)炎癥;2）在血壓正常的W

9、KY大鼠提前干擾RVLM內(nèi)PI3K通路能否減弱AngⅡ誘導的血壓升高和RVLM神經(jīng)炎癥;3）PI3K通路是否參與過表達ACE2減弱高血壓大鼠RVLM神經(jīng)炎癥發(fā)揮抗高血壓效應。
　　[研究方法]
　　實驗中所用的動物為體重280-320g的雄性WKY大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)。WKY大鼠通過第四腦室灌注LPS或AngⅡ來誘導神經(jīng)炎癥。通過Elisa和免疫熒光分

10、別檢測各組大鼠RVLM內(nèi)促炎細胞因子水平和小膠質(zhì)細胞激活情況，Western blot檢測各組大鼠RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基的表達以及AKT的磷酸化水平。通過RVLM內(nèi)注射相關慢病毒來特異性干擾RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基表達和過表達ACE2，最后在SHR進行驗證。
　　[結(jié)果]
　　一、干擾RVLM內(nèi)PI3K信號通路減弱高血壓RVLM內(nèi)神經(jīng)炎癥。
　　WKY大鼠RVLM內(nèi)注射攜帶有GFP基因慢病毒15天

11、后通過熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)RVLM內(nèi)局限地表達GFP綠色熒光。為了驗證攜帶有PI3K-p110δ-shRNA的慢病毒的干擾效率，感染病毒后，大鼠RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基的表達顯著降低，并觀察到SHR相比于WKY大鼠RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基的表達顯著增加。另外，相比于WKY大鼠，SHR-RVLM內(nèi)促炎細胞因子含量(IL-1β:55.9±18.2 vs.141.8±7.54pg/mg,P＜0.05; IL-6:309±18.2

12、 vs.598±26.0 pg/mg,P＜0.05;TNF-α:56.3±3.76vs.98.0±15.4 pg/mg，P＜0.05)，麻醉狀態(tài)下血壓(125±2.50 vs.183±8.05 mmHg)，心率(363±10.6 vs.441±11.4 bpm)和基礎RSNA(11.3±0.514 vs.38.0±2.03％Max)也顯著增加。重要的是，SHR提前干擾RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基可以顯著減少RVLM內(nèi)IL-1β、I

13、L-6和TNF-α的含量水平，以及改善麻醉狀態(tài)下和清醒狀態(tài)下心血管功能。而在WKY大鼠中，RVLM內(nèi)干擾PI3K-p110δ亞基的表達對其血壓和心率沒有影響。
　　二、干擾RVLM內(nèi)PI3K信號通路減弱AngⅡ誘導的神經(jīng)炎癥和心血管功能異常。
　　第四腦室灌注AngⅡ可以顯著增加WKY大鼠RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基的表達和AKT的473位絲氨酸磷酸化水平。為進一步明確PI3K對AngⅡ誘導的神經(jīng)炎癥的影響，在WKY大

14、鼠第四腦室灌注AngⅡ之前在RVLM內(nèi)注射攜帶有PI3K-p110δ-shRNA基因的慢病毒。WKY大鼠第四腦室灌注AngⅡ一周后，心血管功能顯著增加(MAP:148±1.89 vs.116±2.75 mmHg; HR:430±10.6 vs.367±14.6 bpm;基礎RSNA:24.6±2.72 vs.10.2±1.00％Max)，并且RVLM內(nèi)促炎細胞因子水平也顯著增加（IL-1β:188±17.7 vs.126±3.76 pg

15、/mg; IL-6:686±35.5 vs.544±5.39 pg/mg;TNF-α:94.5±5.94 vs.66.0±3.55 pg/mg），相比于第四腦室灌注aCSF的WKY大鼠。有趣的是，第四腦室灌注AngⅡ誘導的促炎細胞因子和心血管功能的增加可以被RVLM內(nèi)預先干擾PI3K-p110δ亞基表達所減弱。
　　三、過表達ACE2抑制PI3K信號通路減弱高血壓大鼠RVLM內(nèi)神經(jīng)炎癥。
　　RVLM內(nèi)注射攜帶有ACE2基因

16、的慢病毒過表達ACE2的效率通過RVLM內(nèi)ACE2蛋白表達水平和Ang-(1-7)/AngⅡ比值顯著增加來確定。相比于第四腦室灌注aCSF的WKY大鼠，通過第四腦室灌注LPS2周的WKY大鼠可以顯著增加血壓、心率和基礎RSNA。第四腦室灌注LPS顯著增加RVLM內(nèi)促炎細胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平;此外，也顯著上調(diào)RVLM內(nèi)PI3K-p110δ亞基的表達以及增加AKT473位絲氨酸的磷酸化水平，這些改變均能被RVLM內(nèi)

17、預先過表達ACE2基因所阻斷。在SHR中，RVLM內(nèi)過表達ACE2四周后可以顯著降低血壓、心率和基礎RSNA。相比于WKY大鼠，SHR-RVLM促炎細胞因子水平顯著增加（IL-1β:92.9±13.3 vs.136±9.62 pg/mg,P＜0.05; IL-6:428±83.8 vs.582±51.5 pg/mg,P＜0.05;TNF-α:40.6±4.0 vs.65.4±11.1 pg/mg，P＜0.05），這些增加的促炎細胞因子可

18、以被過表達ACE2所降低。而且過表達ACE2也可以顯著減少PI3K-p110δ亞基的表達以及AKT磷酸化水平。然而，WKY大鼠RVLM過表達ACE2可以對血壓和PI3K信號并無影響。
　　[結(jié)論]
　　RVLM內(nèi)PI3K/AKT通路激活介導的神經(jīng)炎癥導致高血壓心血管功能異常，RVLM內(nèi)干擾PI3K通路能抑制AngⅡ誘導神經(jīng)炎癥和心血管功能異常，而RVLM特異性過表達ACE2通過抑制PI3K/AKT通路活性減弱高血壓RVLM神