Sonic hedgehog-PI3K-AKt信號(hào)通路在帕金森病炎癥模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激小鼠小膠質(zhì)瘤細(xì)胞（BV2）建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活模型，應(yīng)用大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12）來模擬多巴胺能（DA）神經(jīng)元。觀察在PI3K/AKt信號(hào)通路抑制劑LY294002抑制該信號(hào)通路的情況下，Sonic hedgehog（SHH）信號(hào)通路激活劑2,6,9-三取代嘌呤化合物（Purmorphamine,PM）激活該通路后對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞促炎因子、抗炎因子、

2、帕金森相關(guān)基因Nurr1的表達(dá)以及其培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響。進(jìn)一步應(yīng)用1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氫吡啶(1-methy1-4-phenvl-1、2、3、6-tetrahvdropvridine,MPTP)來誘導(dǎo)小鼠帕金森病模型，LY294002鼻腔給藥抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后，觀察PM腹腔注射激活SHH信號(hào)通路對(duì)小鼠行為學(xué)、小膠質(zhì)細(xì)胞、炎癥因子以及多巴胺能神經(jīng)元的影響。為帕金森病的臨床治療和用藥提供新的策略和

3、理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)和體外兩部分實(shí)驗(yàn)。
　　第一部分 Sonic hedgehog/PI3K/AKt信號(hào)通路對(duì)帕金森病炎癥細(xì)胞模型的影響
　　目的：
　　應(yīng)用LPS刺激BV2細(xì)胞建立小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥激活模型，探討SHH信號(hào)通路的激活對(duì)LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的抑炎作用是否與PI3K/AKt信號(hào)通路有關(guān)。
　　方法：
　　應(yīng)用LPS刺激BV2細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通過Western Bloting實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)炎

4、癥反應(yīng)中PI3K/AKt信號(hào)通路的標(biāo)志物P-AKt蛋白的表達(dá)情況以及SHH信號(hào)通路與PI3K/AKt信號(hào)通路的關(guān)系；應(yīng)用LY294002處理BV2細(xì)胞來抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,Q-PCR)來檢測(cè)PM激活SHH信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞的促炎因子IL-1β、TNF-a和抗炎因子TGF-β以及帕金森病相關(guān)基因Nurr1 mRNA的表達(dá)情況；通過CCK

5、-8檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響。
　　結(jié)果：
　　1）Western Bloting實(shí)驗(yàn)顯示：
　　①與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中有PI3K/AKt信號(hào)通路的抑制（P＜0.01）；
　?、谂cLPS組相比，SHH信號(hào)通路的激活對(duì)LPS刺激下的P-AKt蛋白有上調(diào)作用（P＜0.01；
　　③與PM+LPS組相比，Cyclopamine抑制SHH信號(hào)通路后明顯抑制SHH信號(hào)通路的上調(diào)P-

6、AKt蛋白作用（P＜0.01）；
　　2）Q-PCR結(jié)果顯示：
　?、倥cLPS組相比，PM激活SHH信號(hào)通路可以明顯抑制炎癥因子IL-1β、TNF-a和帕金森病相關(guān)基因Nurr1 mRNA的表達(dá)（均P＜0.01），上調(diào)抗炎因子TGF-βmRNA的表達(dá)（P＜0.01）；
　?、谂cPM+LPS組相比，LY294002預(yù)處理抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后明顯上調(diào)IL-1β、TNF-a mRNA的表達(dá)（均P＜0.01），下調(diào)N

7、urr1、TGF-βmRNA的表達(dá)（均P＜0.01）；
　?、叟cLPS組相比，LY+LPS組明顯上調(diào)IL-1β、TNF-a以及TGF-βmRNA的表達(dá)（均P＜0.01），明顯抑制Nurr1 mRNA的表達(dá)（P＜0.01）；
　　3）CCK-8結(jié)果顯示：
　　①與對(duì)照組相比，LPS組的上清培養(yǎng)液誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.01）；
　?、谂cLPS組相比，PM+LPS組的培養(yǎng)液可以促進(jìn)PC12細(xì)胞的存活

8、率（P＜0.01）；
　　③與PM+LPS組相比，LY294002+PM+LPS組培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞的存活率有一定的抑制作用（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.炎癥反應(yīng)中有PI3K/AKt信號(hào)通路的抑制；
　　2.SHH信號(hào)通路對(duì)PI3K/AKt信號(hào)通路有一定的調(diào)控作用；
　　3.SHH信號(hào)通路的激活能降低 LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)抗炎因子TGF-β的表達(dá)、抑制帕金森病相關(guān)基因Nurr1表達(dá)；

9、>　　4.SHH信號(hào)通路發(fā)揮的抑制炎癥作用以及PC12細(xì)胞的保護(hù)作用與PI3K/AKt信號(hào)通路有關(guān)。
　　第二部分 Sonic hedgehog/PI3K/AKt信號(hào)通路對(duì)帕金森病模型中神經(jīng)炎癥、多巴胺能神經(jīng)元以及行為學(xué)的影響
　　目的：
　　應(yīng)用MPTP制作急性帕金森病模型，觀察SHH信號(hào)通路的激活在帕金森病模型的神經(jīng)炎癥中發(fā)揮多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用是否與PI3K/AKt信號(hào)通路有關(guān)。
　　方法：
　　

10、MPTP造就急性PD模型，通過Western Bloting實(shí)驗(yàn)來檢測(cè) PD模型中PI3K/AKt信號(hào)通路的表達(dá)情況以及體內(nèi)SHH信號(hào)通路激活對(duì)PI3K/AKt信號(hào)通路的影響，LY294002（LY）鼻腔給藥抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后，PM腹腔注射激活體內(nèi)SHH信號(hào)通路，通過懸掛實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠行為學(xué)情況，免疫組織化學(xué)染色和 Western Bloting實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞和DA能神經(jīng)元的表達(dá)情況以及Q-PCR檢測(cè)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情

11、況。
　　結(jié)果：
　　1）Western Bloting（WB）結(jié)果顯示：
　?、倥c對(duì)照組相比，PD模型中有PI3K/AKt信號(hào)通路的抑制（P＜0.01）；
　　②與MPTP組相比，SHH信號(hào)通路的激活對(duì)P-AKt蛋白有上調(diào)作用（P＜0.01）；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY294002預(yù)處理后，能夠明顯抑制PI3K/AKt信號(hào)通路；
　　2）Iba1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：
　?、倥c對(duì)

12、照組相比，PD模型黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，胞體變大、染色深、突起變短增粗；
　　②與MPTP組相比，PM+MPTP組的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，胞體小、突起細(xì)長(zhǎng)；
　?、跮Y+PM+MPTP組中的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量、大小、狀態(tài)與MPTP組以及LY+MPTP組中的小膠質(zhì)細(xì)胞類似；
　　3）Iba1 WB結(jié)果顯示：
　　①與對(duì)照組相比，MPTP組Iba1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；
　?、谂cMPTP組相比，SH

13、H信號(hào)通路的激活后明顯下調(diào)Iba1蛋白表達(dá)，LY+MPTP組中的Iba1蛋白上調(diào)更顯著（均P＜0.01）；
　　③與PM+MPTP組相比，LY294002預(yù)處理可以改善SHH信號(hào)對(duì)Ibal蛋白的抑制作用（P＜0.01）；
　　4）TH免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：
　?、倥c對(duì)照組相比，PD模型黑質(zhì)中THDA能神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，胞體形態(tài)不完整，胞漿染色淺；
　　②與MPTP組相比，PM+MPTP組的THDA能神經(jīng)元數(shù)

14、量增多，胞體形態(tài)比較完整，輪廓清晰，胞漿染色深；LY+MPTP組中的TH DA能神經(jīng)元數(shù)量稍減少，形態(tài)、著色相差不大；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY+PM+MPTP組中的TH DA能神經(jīng)元數(shù)量減少，形態(tài)不完整，著色淺；
　　5）THWB結(jié)果顯示：
　　①與對(duì)照組相比，MPTP組TH蛋白表達(dá)明顯下降；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的TH蛋白表達(dá)上調(diào)，LY+MPTP組中的TH蛋白下調(diào)；
　?、?/p>

15、與PM+MPTP組相比，LY294002明顯抑制SHH信號(hào)的誘導(dǎo)的TH上調(diào)作用；
　　6）Q-PCR結(jié)果顯示：
　?、倥c對(duì)照組相比，MPTP組的炎癥因子IL-1β、TNF-a表達(dá)上調(diào)；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的IL-1β、TNF-a表達(dá)下調(diào)，LY+MPTP組中的IL-1β、TNF-a表達(dá)上調(diào)；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY294002明顯抑制SHH信號(hào)的誘導(dǎo)的IL-1β、TNF-a的下調(diào)作

16、用；
　　7）懸掛實(shí)驗(yàn)顯示：
　?、倥c對(duì)照組相比，PD模型鼠懸掛時(shí)間得分明顯降低（P＜0.01）；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的小鼠懸掛時(shí)間得分明顯升高（P＜0.01）；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY294002抑制PI3K/AKt信號(hào)通路后能夠明顯抑制SHH信號(hào)的促懸掛時(shí)間得分（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.PD模型中有PI3K/AKt信號(hào)通路的抑制；
　　2.體內(nèi)