Sonic Hedgehog及PI3K-Akt信號通路在三甲基氯化錫致神經(jīng)元損傷中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分 TMT中毒整體動物模型及腦膜片鉗技術(shù)的建立
　　目的：建立TMT中毒的整體動物體內(nèi)與腦膜片鉗模型，探討TMT對小鼠的一般毒性作用、神經(jīng)行為及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　方法：整體動物模型：48只雄性昆明種小鼠隨機分為6組，每組8只；分為TMT染毒組：0.25、0.75、1.25 mg/kg和對照組（生理鹽水），LBP組（2 g/kg）以及干預(yù)組（TMT1.25 mg/kg+LBP2g/kg）。對照組及TMT組每日上午

2、8點腹腔注射連續(xù)給藥5天；LBP及干預(yù)組自TMT染毒前3天預(yù)先LBP經(jīng)口灌胃，直至染毒結(jié)束。TMT染毒當(dāng)晚8點進行一般行為學(xué)評分與Racine癲癇評分，共5天；末次給藥24 h后斷頭處死動物，分離腦并計算腦臟器系數(shù)；每組4只小鼠各保留一半腦，一半用于免疫組化，另一半與其余4只動物的大腦均分離海馬，-80℃凍存?zhèn)溆谩ＤX膜片鉗模型：設(shè)對照組（生理鹽水）和TMT組（1.25 mg/kg），每組3只雄性昆明種小鼠。腹腔注射5天，麻醉后游離海馬，

3、檢測海馬CA1區(qū)LTP的改變。
　　結(jié)果：（1）小鼠體重及腦臟器系數(shù)變化：與對照組相比，1.25 mg/kg組TMT染毒第3天開始體重明顯下降（P<0.05），與單獨TMT組相比，干預(yù)組體重明顯高于單獨TMT組，第8天體重差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與對照組相比，TMT高劑量組及干預(yù)組腦臟器系數(shù)升高（P<0.01）；（2）一般行為變化：TMT可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀，中劑量和高劑量組自TMT給藥第3天至染毒結(jié)束均表現(xiàn)出

4、一般中毒癥狀，癥狀評分分值升高，第4、5天癥狀評分持續(xù)增長，顯著高于對照組（P<0.01）；按Racine癲癇評分，TMT可誘發(fā)小鼠癲癇，所有劑量組在TMT染毒初期均無明顯癥狀，癲癇分級在0級，TMT染毒完畢后（第5天），對照組及LBP組所有動物仍為0級，0.25 mg/kg組75％的動物在0級，0.75 mg/kg25%動物在1級，25%動物在2級，其余動物在0級，1.25 mg/kg組所有動物在3級以上，其中12.5%在5級，62.

5、5%為4級；與1.25 mg/kg組相比，干預(yù)組中毒癥狀及癲癇評分均有所下降；（3）學(xué)習(xí)記憶能力改變：應(yīng)用海馬腦片盲法膜片鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TMT可引起小鼠海馬CA1區(qū)LTP降低，明顯低于對照組（P<0.01）。
　　結(jié)論：本實驗室成功建立TMT中毒小鼠整體動物模型，0.75 mg/kg TMT即能引起小鼠中毒一般癥狀的發(fā)生，并可觀察到攻擊性、易激惹、輕微震顫等癥狀；1.25 mg/kg TMT可引起持續(xù)性震顫、癲癇發(fā)作以及體重降低等明

6、顯的神經(jīng)系統(tǒng)中毒表現(xiàn)。TMT給藥前3天預(yù)先給予LBP，并持續(xù)給藥至染毒結(jié)束，中毒癥狀有所減輕，LBP對TMT引起的神經(jīng)毒性有一定的保護作用。1.25 mg/kg TMT可引起昆明種小鼠海馬CA1區(qū)長時程增強效應(yīng)降低，從電生理角度，觀察到其對學(xué)習(xí)記憶功能有影響。
　　第二部分 TMT對小鼠海馬神經(jīng)元損傷的分子生物學(xué)機制研究
　　目的：利用整體動物模型研究 TMT對小鼠海馬神經(jīng)元的損傷及其分子生物學(xué)機制。
　　方法：尼氏染

7、色及神經(jīng)元免疫熒光觀察神經(jīng)元損傷；TBA法檢測 MDA變化；WST-1法檢測SOD的改變；免疫組織化學(xué)法檢測Sonic Hedgehog變化；Western blot檢測Sonic Hedgehog、PI3K/Akt信號通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Bcl2/Bax的改變。
　　結(jié)果：（1）神經(jīng)元損傷：尼氏染色結(jié)果可見，中、高劑量組海馬各區(qū)神經(jīng)元排列紊亂、細胞數(shù)量減少、間隙變大、細胞腫脹、尼氏小體減少；免疫熒光結(jié)果顯示：中劑量組小鼠海馬D

8、G區(qū)即受損、神經(jīng)元缺失，高劑量組海馬各區(qū)神經(jīng)元均出現(xiàn)缺失；LBP可減輕TMT誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷。（2）TMT對小鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白的影響：與對照組相比，各 TMT劑量組海馬神經(jīng)元的Bcl-2表達水平下降，而 Bax表達水平升高。與TMT組相比，干預(yù)組Bcl-2蛋白表達升高，Bax表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；（3）MDA及SOD結(jié)果顯示，隨著TMT染毒劑量的升高，海馬MDA水平呈上升趨勢，與對照組相比，中劑量組和高

9、劑量組及干預(yù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與對照組相比，海馬SOD水平隨著TMT染毒濃度的升高而降低，高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與1.25 mg/kg TMT組相比，干預(yù)組SOD表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；（4）Sonic Hedgehog蛋白表達變化：中、高劑量組海馬CA區(qū)Shh蛋白明顯減少，表現(xiàn)為棕黃色顆粒物減少；（5）蛋白免疫印跡法檢測小鼠海馬Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號通路蛋白表達的變

10、化：與對照組相比，TMT低劑量和中劑量組Shh蛋白表達水平降低，高劑量組上升，總Akt及總GSK-3β水平各組之間無明顯差異，p-Akt及 p-GSK-3β表達隨著染毒劑量的增加而降低；與1.25 mg/kgTMT組相比，干預(yù)組Shh、p-Akt及p-GSK-3β表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：TMT在整體動物模型中，可引起神經(jīng)元尼氏體的丟失，神經(jīng)元損傷及缺失，利用尼氏染色和免疫熒光方法證實TMT神經(jīng)損傷

11、的細胞水平物質(zhì)基礎(chǔ)；發(fā)現(xiàn)TMT可造成細胞凋亡和氧化應(yīng)激的異常，其分子生物學(xué)機制涉及Sonic Hedgehog信號通路的抑制，表現(xiàn)為關(guān)鍵蛋白Shh及Gli1表達的降低；PI3K/Akt信號通路的抑制，體現(xiàn)為該通路關(guān)鍵蛋白p-Akt的抑制與GSK-3β的活化；脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生等。
　　第三部分 Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號通路在TMT致N2a細胞凋亡模型中的作用
　　目的：建立 TMT中毒的體外神經(jīng)細

12、胞模型，確認(rèn) Sonic Hedgehog與 PI3K/Akt信號通路是否參與介導(dǎo)TMT引起的N2a細胞凋亡，并探討LBP對TMT神經(jīng)毒作用的保護作用。
　　方法：MTT法測定細胞存活率；Hoechst染色觀察細胞凋亡；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；ELISA法檢測caspase-3的變化；DCFH-DA法檢測ROS的改變；TBA法檢測MDA的變化；WST-1法檢測SOD的改變；WB檢測Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號

13、通路及Bcl-2、Bax等蛋白的改變； RT-PCR檢測Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號通路相關(guān)mRNA的表達。
　　結(jié)果：（1）TMT對N2a細胞存活率的影響：與正常對照組相比，3.75及7.5μmol/L TMT作用24 h，細胞存活率明顯下降（P<0.05），并具有劑量反應(yīng)關(guān)系；形態(tài)學(xué)觀察，3.75μmol/L與7.5μmol/L TMT作用24 h后，細胞數(shù)目明顯減少，突觸回縮，細胞貼壁能力減弱，呈球狀漂

14、?。唬?）TMT對 N2a細胞凋亡的影響：與正常對照組相比，3.75μmol/L與7.5μmol/L TMT作用24 h，細胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增加（P<0.01）；Hoechst33258染色可見3.75μmol/L與7.5μmol/L TMT作用24 h可使染色體聚集，DNA裂解；Western blot對Bcl-2與Bax蛋白表達進行定量分析，結(jié)果顯示，隨著染毒劑量增加，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05），而Ba

15、x蛋白水平顯著增加（P<0.01）；（3）caspase級聯(lián)反應(yīng)活化：3.75μmol/L與7.5μmol/L TMT作用24 h可使caspase-9 mRNA表達與caspase-3表達顯著升高（P<0.05），LBP可降低caspase的活化（P<0.05）；（4）氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生：與對照組相比，TMT染毒24 h使得ROS與MDA表達水平升高，SOD表達降低。與TMT組相比，LBP可降低ROS與MDA，并使SOD升高（P<0.

16、05）；（5）Sonic Hedgehog及PI3K/Ak信號通路抑制：隨著TMT染毒劑量的增加，作用24 h后Shh與Gli1蛋白及Smo mRNA表達降低，Ptch及Sufu的mRNA表達升高（P<0.05）；Akt與GSK-3β磷酸化蛋白及PDK1 mRNA表達顯著降低（P<0.05）；而各劑量組TMT對總Akt及GSK-3β蛋白表達變化無明顯影響；兩條信號通路下游蛋白C-Myc與Cyclin D表達減少（P<0.05）。與3.7

17、5μmol/L TMT組相比，LBP對以上指標(biāo)的改變均有保護作用（P<0.05）。
　　結(jié)論：本試驗選擇N2a細胞為實驗?zāi)Ｐ?，TMT染毒劑量為1.875，3.75，7.5μmol/L，LBP給藥濃度為300μg/mL，染毒時間為24 h，以細胞凋亡和氧化應(yīng)激為最終毒性指標(biāo)，呈現(xiàn)出良好的劑量-毒效應(yīng)關(guān)系。以此為信號通路的研究模型，發(fā)現(xiàn)可引起 N2a細胞發(fā)生凋亡，氧化損傷作用，同時抑制Sonic Hedgehog與PI3K/Ak信號通

18、路，表現(xiàn)為 Sonic Hedgehog通路蛋白 Shh與 Gli1表達的減少及 PI3K/Akt通路蛋白 Akt及GSK-3β磷酸化程度的降低。LBP對TMT誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)元損傷具有保護作用。提示細胞凋亡、氧化損傷、Sonic Hedgehog及PI3K/Akt信號通路的抑制可能參與TMT的神經(jīng)毒作用機制。
　　第四部分 TMT致N2a細胞損傷模型中Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號通路的“Crosstalk”<

19、br>　　目的：以兩條信號通路的特異性抑制劑為工具，進一步從蛋白及RNA表達層面研究TMT致N2a細胞凋亡模型中Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號通路的“Cross-talk”，GSK-3β在其中扮演的角色及氧化應(yīng)激與兩條信號通路的關(guān)系，并觀察各抑制劑對TMT致N2a細胞凋亡的影響，以探討其毒性途徑。
　　方法： LY294002預(yù)處理N2a細胞1 h，GDC-0449預(yù)處理細胞2 h后，TMT染毒24 h，MTT

20、檢測細胞存活率改變；流式細胞術(shù)分析各抑制劑對TMT導(dǎo)致的細胞凋亡的影響；RT-PCR檢測 caspase-9 mRNA改變，ELISA法檢測 caspase-3的變化；DCFH-DA法檢測ROS的改變，TBA法檢測MDA的變化；WST-1法檢測SOD的改變；RT-PCR檢測Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號通路相關(guān)mRNA的表達，Western blot檢測通路相關(guān)蛋白表達變化。
　　結(jié)果：（1）抑制劑對細胞存活率

21、的影響：與TMT單獨染毒組相比，Sonic Hedgehog通路抑制劑GDC-0449與PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理并染毒后細胞存活率降低（P<0.05）；細胞回縮，變圓，細胞數(shù)量減少。
　?。?）抑制劑對細胞凋亡的影響：Sonic Hedgehog通路抑制劑GDC-0449與PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理細胞后再進行TMT染毒，細胞總凋亡率顯著高于TMT單獨染毒組，其中LY294002預(yù)處理

22、，晚期凋亡率高于單獨TMT染毒組（P<0.01）。抑制劑預(yù)處理可使caspase-9 mRNA及caspase-3的表達水平升高（P<0.01）。
　?。?）抑制劑對氧化應(yīng)激的影響：與單獨 TMT染毒組相比，10μmol/L PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理或30μmol/L Hedgehog通路特異性抑制劑GDC-0449預(yù)處理，均可使細胞 ROS熒光強度增加，表達升高（P<0.01）；MDA表達水平上升（P<0

23、.01）；SOD表達水平降低（P<0.01）。
　?。?）PI3K/Akt信號通路：與TMT單獨染毒組相比，10μmol/L PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理1 h，可使磷酸化GSK-3β表達降低（P<0.01）；Ptch、Sufu的mRNA表達升高（P<0.01）；Smo、PDK1的mRNA及 Shh、Gli1的蛋白水平降低（P<0.01）。
　?。?）Sonic Hedgehog信號通路：與TMT單獨染毒

24、組相比，30μmol/L Hedgehog通路抑制劑GDC-0449預(yù)處理2 h可使磷酸化Akt及磷酸化GSK-3β表達降低（P<0.05）；PDK1的mRNA表達降低（P<0.05），Sufu的mRNA表達升高（P<0.01）。
　　結(jié)論：在TMT致細胞凋亡模型中，Sonic Hedgehog與PI3K/Akt信號通路的抑制可促使細胞凋亡率增加，caspase-9及caspase-3表達升高，具有促進細胞凋亡的作用，并能誘導(dǎo)氧化