機械性神經元損傷后自噬的功能及Homer1a通過PI3K-Akt通路對其調節(jié)作用.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)傷性腦損傷(Traumaticbraininjury,TBI)是一種常見的高致殘致死性中樞神經系統(tǒng)疾病,分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷,原發(fā)性腦損傷可以通過加強預防來減少發(fā)生,而由原發(fā)性損傷所繼發(fā)的一系列腦損害必須通過藥物干預來改善。目前認為,繼發(fā)性腦損傷的主要機制包括氧自由基的生成、興奮性毒性氨基酸釋放、鈣離子超載和炎癥反應等,已有研究表明,這些機制與突觸致密物質(postsynapticdensity,PSD

2、)和突觸間信號傳遞密切相關。Homer蛋白家族分子主要存在于哺乳動物神經元PSD中,與其它PSD蛋白相互作用,在不同的腦組織和結構中發(fā)揮著不一樣的功能。Homer1b/c是Homer1蛋白的亞型之一,為PSD中的重要支架蛋白,本課題組前期研究證實,離體神經元TBI后Homer1b/c呈持續(xù)穩(wěn)定表達,下調Homer1b/c明顯降低離體神經元TBI導致的損害,可以通過內質網(wǎng)和線粒體途徑在一定程度上減弱外源性谷氨酸導致的皮層神經元損傷;由即早

3、基因(immediate-earlygene,IEG)編碼的另一種Homer1蛋白亞型Homer1a在離體神經元TBI后呈動態(tài)高表達,過表達Homer1a在過氧化氫誘導的PC12細胞損傷中發(fā)揮保護性作用。
　　自噬(Autophagy)是一種生物進化保守的溶酶體降解途徑,能夠清除細胞內異常或功能障礙的大分子或細胞器,來維持細胞能量平衡和內環(huán)境穩(wěn)定。目前認為,適當?shù)淖允蓪毎斜Ｗo作用,自噬過少或過多對細胞均有損害作用。大量研究表明

4、,自噬在中樞神經系統(tǒng)疾病中廣泛存在,并發(fā)揮重要作用。TBI后有顯著自噬發(fā)生,但其功能和調節(jié)機制尚不明確。本課題研究了自噬在神經元機械性損傷中的發(fā)生規(guī)律和功能,以及Homer1a蛋白對神經元機械性損傷誘導自噬的調節(jié)作用及其機制。
　　第一部分神經元機械性損傷后自噬的發(fā)生規(guī)律
　　目的：明確小鼠大腦皮層離體神經元機械性損傷后自噬的發(fā)生規(guī)律。方法：(1)細胞培養(yǎng):昆明小鼠皮層神經元培養(yǎng);(2)建立模型:建立穩(wěn)定可靠的離體神經元機械

5、性損傷模型模擬創(chuàng)傷性腦損傷;(3)細胞自噬監(jiān)測:采用Westernblot檢測LC3Ⅱ和Beclin-1的表達;采用透射電鏡觀察神經元細胞質內自噬小體和自噬溶酶體數(shù)量;使用免疫熒光法檢測LC3,觀察自噬小體的數(shù)量變化;(4)自噬的干預:使用自噬激動劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預自噬。結果：小鼠大腦皮層離體神經元機械性損傷后3h自噬標志性相關分子LC3Ⅱ表達開始增加,且隨時間變化逐漸增高;損傷組神經元Beclin-1分子表達顯著高于對

6、照組,但無明顯時間變化趨勢。免疫熒光法檢測LC3證明,損傷后24h神經元自噬明顯增加。電鏡可見,離體神經元機械性損傷后24h胞質內有大量自噬小體或自噬溶酶體。結論：離體神經元機械性損傷后有顯著自噬發(fā)生。
　　第二部分PI3K-Akt信號通路對神經元機械性損傷后自噬的調節(jié)作用
　　目的：研究PI3K-Akt信號通路對神經元機械性損傷誘導自噬的調節(jié)作用。方法：(1)抑制PI3K-Akt信號通路:使用三個不同濃度(12.5μM、2

7、5μM和50μM)的PI3K抑制劑LY294002預處理,采用Westernblot檢測p-Akt來探索最佳抑制濃度;(2)自噬的干預:使用自噬激動劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預自噬;(3)自噬檢測:采用Westernblot檢測LC3Ⅱ和Beclin-1的表達。結果：神經元機械性損傷后1hp-Akt表達開始增高,3h達到峰值,之后趨于下降,在24h基本回到正常水平;濃度為25μM的LY294002對PI3K抑制效果最明顯,抑制PI

8、3K后p-Akt顯著下調,同時LC3Ⅱ和Beclin-1表達顯著增高。結論：PI3K-Akt信號通路對神經元機械性損傷后自噬有負調節(jié)作用。
　　第三部分神經元機械性損傷誘導自噬的作用和功能
　　目的：探索自噬在神經元機械性損傷后的作用和功能。方法：(1)神經元機械性損傷程度檢測:采用LDH試劑盒、MTT法檢測神經元活性;(2)自噬的干預:使用自噬激動劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預自噬;(3)自噬檢測:采用Westernb

9、lot檢測LC3Ⅱ和Beclin-1的表達;(4)凋亡檢測:采用Westernblot檢測cleaved-Caspase3、Caspase3;TUNEL染色。結果：無論損傷前1h還是損傷后1h抑制自噬,LDH值均增高,損傷前抑制自噬神經元釋放LDH的值較損傷后抑制自噬略高;無論損傷前1h還是損傷后1h抑制自噬,MTT值均降低,且損傷前抑制自噬比損傷后抑制自噬MTT值略低。損傷前1h激動自噬,神經元LDH釋放增高,損傷后1h激動自噬LDH

10、值則較對照組明顯降低;MTT法檢測細胞活性,結果顯示損傷前1h激動自噬,神經元MTT值高于對照組,損傷后1h激動自噬MTT值則明顯低于對照組。進一步研究發(fā)現(xiàn),損傷后1h抑制自噬,損傷后24h神經元cleaved-Caspase3表達降低,TUNEL陽性細胞減少;損傷后1h激動自噬,損傷后24h神經元cleaved-Caspase3表達升高,TUNEL陽性細胞增加。結論：無論在神經元機械性損傷前1h還是損傷后1h抑制自噬,均降低神經元活性

11、;神經元機械性損傷前1h激動自噬細胞活性較對照組無顯著差異,而損傷后1h激動自噬細胞活性明顯改善。損傷后1h抑制自噬,神經元凋亡減少;損傷后1h激動自噬,神經元凋亡增加。
　　第四部分Homer1a對神經元機械性損傷后自噬的調節(jié)作用及機制
　　目的：探索Homer1a對神經元機械性損傷后自噬的調節(jié)作用及機制。方法：(1)Homer1a調節(jié):構建Homer1a過表達和干涉載體,通過慢病毒轉染來上調和下調Homer1a表達;(2

12、)自噬的干預:使用自噬激動劑雷帕霉素和自噬抑制劑3-MA干預自噬;(3)抑制PI3K-Akt信號通路:使用濃度為25μM的PI3K抑制劑LY294002預處理;(4)分子表達:采用Westernblot檢測活化Homer1a、p-Akt、T-Akt、LC3Ⅱ和Beclin-1的表達。結果：皮層神經元機械性損傷后1hHomer1a蛋白表達開始增加,6h為表達高峰,之后趨于下降;免疫熒光法檢測可見,損傷后6hHomer1a蛋白在神經元上表達

13、顯著高于對照組,主要分布于胞質的胞膜側和突起。過表達Homer1a可使損傷后神經元p-Akt表達降低,同時LC3Ⅱ和Beclin-1表達升高,細胞活性改善;干涉Homer1a可使損傷后神經元p-Akt表達升高,LC3Ⅱ和Beclin-1表達降低,細胞活性降低。使用LY294002抑制PI3K,損傷神經元Homer1a蛋白表達上調;使用3-MA抑制自噬,損傷神經元Homer1a蛋白表達下調,使用雷帕霉素激動自噬,損傷神經元Homer1a蛋