PI3K-Akt-NO信號(hào)通路在緩激肽保護(hù)阿霉素致心肌細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、目的：阿霉素（DOX）是臨床常用的抗惡性腫瘤藥物，具有抗瘤譜廣、抗瘤活性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛用于多種惡性腫瘤的治療。然而阿霉素在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生劑量依賴的心臟毒副作用，主要表現(xiàn)為擴(kuò)張性心肌病和嚴(yán)重心力衰竭。目前研究認(rèn)為氧化應(yīng)激、線粒體損傷、鈣超載和細(xì)胞凋亡是DOX心肌毒性的主要機(jī)制。緩激肽（bradykinin, BK）是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（KKS）的終末產(chǎn)物，KKS是一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)源性多酶系統(tǒng)，廣泛參與炎癥、血管擴(kuò)張、血管生成、

2、凝血及疼痛等生理和病理過(guò)程。許多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究已證實(shí)心肌梗死、糖尿病、高血壓、心力衰竭和左心室肥厚等疾病的發(fā)生均與KKS的活性降低有關(guān)，但KKS是否與藥源性心肌疾病如阿霉素心肌病有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在建立 DOX心肌損傷的細(xì)胞毒性模型，在細(xì)胞水平上探討B(tài)K對(duì)DOX所致心臟毒性的影響及其可能的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制。
　　方法：⑴H9c2細(xì)胞加入不同濃度的DOX（0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μ

3、M），分別作用12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，觀察DOX對(duì)H9c2細(xì)胞的時(shí)間和濃度依賴性毒性。⑵將H9c2細(xì)胞和AC16細(xì)胞分別與不同濃度DOX（0.01μM、0.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM及100μM）共同孵育24 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，確定使兩種細(xì)胞存活率降低50％的DOX濃度。⑶兩種細(xì)胞分別加入10μM、1μM、0.1μM BK預(yù)處理，孵育30 min

4、后加入DOX1μM（H9c2細(xì)胞）或5μM（AC16細(xì)胞），24 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，觀察BK對(duì)DOX所致的心肌細(xì)胞毒性是否有抑制作用。⑷將BK0.1μM和H9c2細(xì)胞共同孵育30 min后加入DOX1μM，分組分別為①Control組②DOX組③BK+DOX組④BK組。取各組培養(yǎng)基上清液和細(xì)胞裂解液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，按MDA、LDH、SOD試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定SOD活性或MDA、LDH水平。⑸H9c2細(xì)胞和A

5、C16細(xì)胞給藥如前，分組如前，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用活性氧分子（ROS）特異性熒光探針2,7-dichlorofluorescenin diacetate(DCFH-DA)1μM染色30 min，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。⑹H9c2細(xì)胞和AC16細(xì)胞給藥如前，分組同前。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用線粒體膜電位特異性熒光探針Rh1230.5μM染色30 min，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。⑺H9c2細(xì)胞給藥如前，分組同前。

6、測(cè)定相應(yīng)組蛋白濃度，Western blot法檢測(cè)凋亡蛋白Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。⑻H9c2細(xì)胞和AC16細(xì)胞孵育BK30 min后分別加入DOX和B2受體抑制劑HOE-140（H）、PI3K抑制劑LY294002（LY）、NOS抑制劑L-NAME（L）和 PLC抑制劑 U-73122（U）。細(xì)胞分組為：Control組、DOX組、BK+DOX組、BK+DOX+H組、BK+DOX+L組、BK+DOX+LY組、BK+DOX+U組

7、。分別用MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞的細(xì)胞存活率，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)ROS水平和MMP變化情況。
　　結(jié)果：①H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示DOX對(duì)H9c2細(xì)胞的毒性具有時(shí)間和濃度依賴性。②H9c2細(xì)胞在給予1μM DOX時(shí)生存率下降50%，AC16細(xì)胞在給予5μM DOX時(shí)生存率下降50%，故在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中分別應(yīng)用1μM DOX和5μM DOX制造阿霉素?fù)p傷模型。③不同濃度BK先于DOX30 min給予細(xì)胞，0.1μM、1μM和10μM

8、 BK均能明顯降低DOX對(duì)H9c2細(xì)胞和AC16細(xì)胞的損傷（P<0.01），但單獨(dú)應(yīng)用1μM和10μM BK能造成AC16細(xì)胞存活率降低（P<0.01），故采用0.1μM BK進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。④DOX使H9c2細(xì)胞裂解液中MDA含量升高、SOD活性降低，使細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平升高（P<0.01），經(jīng)BK預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)SOD活性回升（P<0.05），MDA含量回降（P<0.01），細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH水平回降（P<0.01）。⑤激光共聚焦

9、顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，DOX作用于H9c2細(xì)胞和AC16細(xì)胞，細(xì)胞腫脹、裂解，細(xì)胞內(nèi)ROS含量皆明顯升高，熒光強(qiáng)度升高（P<0.01），應(yīng)用BK后，ROS含量明顯下降（P<0.01）。⑥D(zhuǎn)OX作用于H9c2細(xì)胞，熒光強(qiáng)度下降，MMP降低（P<0.01）。應(yīng)用BK后，MMP有所恢復(fù)（P<0.05）。⑦H9c2細(xì)胞給予DOX后24 h后，Bax/bcl-2比值升高（P<0.01），與BK聯(lián)用后比值降低（P<0.05）。⑧給予BK的同時(shí)給予 B