PI3K-Akt-FoxO3a信號通路在FGF-2拮抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：探討FGF-2拮抗氧化應(yīng)激引起的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的新機制。
　　方法：
　　1.采用體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞，用不同濃度（0，50，100，200，400μmol/L）的H2O2處理6h，用MTT法篩選出H2O2引起細(xì)胞凋亡的最適濃度；用不同濃度（0，2.5，5，10，20ng/ml）的FGF-2與培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞共同孵育0.5h，再用H2O2刺激6h后，用MTT法篩選FGF-2拮抗H2O2引起的細(xì)胞凋亡的

2、最適濃度；
　　2.100μmol/L H2O2處理 H9c2心肌細(xì)胞不同時間后，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Akt, p-Akt, FoxO3a, p-FoxO3a和Bim蛋白的表達(dá)變化。
　　3.進一步實驗分組：(l)對照組：以不含F(xiàn)GF-2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞45min；(2) H2O2組：培養(yǎng)液中加入終濃度為100μmol/L H2O2刺激45min；(3) FGF-2+H2O2組：以含10ng

3、/ml FGF-2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞30min后，100μmol/LH2O2刺激45min；(4) FGF-2+H2O2+LY294002（PI3K/Akt信號通路抑制劑）組：以含10 ng/ml FGF-2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞30min后，100μmol/L H2O2刺激45min，其中10μmol/L的LY294002在加H2O21h前加入。采用MTT法檢測H9c2心肌細(xì)胞的活力，Hoechst33258染色、TUNEL染

4、色、流式細(xì)胞術(shù)檢測 H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率；Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Akt, p-Akt, FoxO3a, p-FoxO3a和Bim蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1. MTT法顯示，H2O2可以明顯降低 H9c2心肌細(xì)胞的活力，F(xiàn)GF-2預(yù)孵育能夠拮抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力降低，在100μmol/L時效果最明顯。故本實驗中選擇的藥物處理濃度：H2O2最適濃度為100μmol/L，F(xiàn)GF-2的最適濃

5、度為10ng/ml。加入PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002后，可以逆轉(zhuǎn)FGF-2對H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力降低的抑制作用。
　　2. Hoechst33258和TUNEL染色結(jié)果顯示：與對照組相比，H2O2組可見大量凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多；與H2O2組比較，F(xiàn)GF-2+H2O2組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯降低；而加入抑制劑 LY294002后，F(xiàn)GF-2+H2O2+LY294002組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯升高，與FGF

6、-2+H2O2組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：H2O2組的細(xì)胞凋亡率為27.24％，明顯高于對照組(P<0.01)；FGF-2預(yù)孵育后， FGF-2+H2O2組細(xì)胞的凋亡率可降至6.21%(P<0.01)；與FGF-2+H2O2組相比，F(xiàn)GF-2+H2O2+LY294002組細(xì)胞的凋亡率升高至17.89%(P<0.05)。
　　4.100μmol/L H2O2作用H9c2心肌細(xì)胞后，隨著時間的遞增，

7、Akt和FoxO3a蛋白的磷酸化水平逐漸降低（P﹤0.05），而Akt和FoxO3a總蛋白表達(dá)變化不明顯；胞核FoxO3a在H2O2作用后表達(dá)開始逐漸增加，胞漿FoxO3a蛋白于H2O2作用后表達(dá)明顯降低，作用45min后表達(dá)降低了39.6%（P<0.05），同時Bim蛋白的表達(dá)明顯增高，孵育45min時增加了165.2%（P<0.05）。
　　5.與H2O2組相比，F(xiàn)GF-2+H2O2組可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)FoxO3a和Akt蛋白

8、的磷酸化（P<0.05）；胞核內(nèi)的FoxO3a蛋白表達(dá)明顯減少，而胞漿內(nèi)的FoxO3a表達(dá)則顯著增加了42.7%（P<0.05）；同時FGF-2+H2O2組細(xì)胞Bim蛋白表達(dá)與H2O2組相比也明顯降低了32.5%(P<0.05)。加入Akt抑制劑LY294002預(yù)先處理，F(xiàn)GF-2+H2O2+LY294002組細(xì)胞Akt和FoxO3a蛋白的磷酸化水平明顯降低；胞核內(nèi)FoxO3a蛋白表達(dá)增加，胞漿內(nèi)FoxO3a蛋白表達(dá)減少，同時細(xì)胞內(nèi)促凋