過表達(dá)肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a對(duì)心肌細(xì)胞PI3K-Akt信號(hào)通路短期作用的研究.pdf

1、心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)展的最終歸宿，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。目前針對(duì)慢性心衰的治療已有長(zhǎng)足發(fā)展，但其五年死亡率仍居高不下。分子生物學(xué)研究提示心力衰竭心肌細(xì)胞中存在某些相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控異常，因此心衰被認(rèn)為是一種多基因突變疾病?；蛑委煘樾牧λソ咛峁┝诵碌闹委熗緩健＜{網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)障礙是各種心力衰竭的共同通路，肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a（sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a）是調(diào)

2、節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的決定因素。既往研究表明，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SERCA2a可以改善心力衰竭心肌細(xì)胞的功能、糾正Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、延長(zhǎng)存活時(shí)間和逆轉(zhuǎn)心室肥厚等。為了更好的評(píng)價(jià)這種治療方法，就必須探討其保護(hù)心肌的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作顯示轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SERCA2a可使心肌細(xì)胞內(nèi)與提供能量有關(guān)的酶類表達(dá)增加，并糾正MHC亞型的異常表達(dá)。其他研究小組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SERCA2a可以糾正心力衰竭時(shí)蛋白激酶B（Akt1）的異常表達(dá)。

3、>　　 蒽環(huán)類抗生素廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的治療，但其存在嚴(yán)重的心臟毒性。心力衰竭是此類藥物心臟毒性的最終表現(xiàn)。研究顯示，蒽環(huán)類藥物影響心肌細(xì)胞SERCA2a蛋白的表達(dá)和功能，SERCA2a功能改變是此類藥物導(dǎo)致心臟毒性的關(guān)鍵因素。另外蒽環(huán)類藥物誘發(fā)心肌毒性與心肌細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平降低有關(guān)。大量事實(shí)證明，多種心肌保護(hù)因子通過激活A(yù)kt通路抑制蒽環(huán)類藥物的心肌毒性。
　　 Akt是一種蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸激酶，心肌細(xì)胞主要表達(dá)A

4、kt1亞型。胰島素等各種生長(zhǎng)因子通過磷酯酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激活A(yù)kt，Akt被激活后廣泛參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、能量代謝和抗調(diào)亡等過程。Akt是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)的中心分子，短期適度激活A(yù)kt對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，而大量長(zhǎng)期激活會(huì)促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生。轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SERCA2a可以改善心力衰竭動(dòng)物的長(zhǎng)期預(yù)后，而過表達(dá)SERCA2a可以糾正心衰心肌細(xì)胞Akt1的異常表達(dá)，

5、因此我們推測(cè)過表達(dá)SERCA2a的長(zhǎng)期有益作用可能與糾正Akt1通路的異常有關(guān)。
　　 本研究在體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞系和原代心肌細(xì)胞，采用重組腺病毒轉(zhuǎn)基因瞬時(shí)過表達(dá)SERCA2a，觀察過表達(dá)SERCA2a對(duì)正常心肌細(xì)胞P13K/Akt信號(hào)通路的作用，并探討此通路下游分子GSK3β和GLUT4活性改變情況，明確在正常心肌細(xì)胞過表達(dá)SERCA2a是否可以激活PI3K/Akt通路。首先，本研究采用HEK-293T細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病

6、毒Ad-GFP和Ad-SERCA2a，并驗(yàn)證擴(kuò)增后的腺病毒在體外可以有效感染目的細(xì)胞。利用Ad-GFP感染H9c2心肌細(xì)胞和MTT實(shí)驗(yàn)觀察病毒感染對(duì)心肌細(xì)胞損傷程度，確定最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）值，為后期實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。其次，通過在體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞系和原代心肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)SERCA2a，觀察對(duì)Akt通路的影響。結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞過表達(dá)SERCA2a可以激活A(yù)kt，Akt磷酸化水平升高，是對(duì)照組的2.7倍（

7、P<0.05）；其下游底物GSK3β磷酸化水平升高，是對(duì)照組的3.1倍（P<0.05）；GLUT4蛋白表達(dá)無明顯變化，但通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)有GLUT4由細(xì)胞漿移位至細(xì)胞膜的現(xiàn)象。進(jìn)一步細(xì)胞膜蛋白分析顯示，過表達(dá)SERCA2a組細(xì)胞膜GLUT4蛋白量增加，是對(duì)照組的2.1倍（P<0.05）。在原代心肌細(xì)胞過表達(dá)SERCA2a也可以激活A(yù)kt通路，Akt磷酸化水平升高，是對(duì)照組的2.1倍（P<0.05）；其下游底物GSK3β磷酸化水平升高

8、，是對(duì)照組的1.6倍（P<0.05）；采用PI3K抑制劑LY294002可以阻斷以上蛋白磷酸化水平改變，提示過表達(dá)SERCA2a通過PI3K激活A(yù)kt通路。最后，采用阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死，觀察過表達(dá)SERCA2a對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷的影響。結(jié)果顯示，阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞LDH漏出量增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子水平升高，SERCA2a蛋白表達(dá)降低。過表達(dá)SERCA2a可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞死亡率降低，心肌細(xì)胞