2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、阿霉素(adriamycin,ADR)屬于蒽環(huán)類抗生素,是一種高效的廣譜抗腫瘤抗生素,臨床上廣泛用于治療乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤。但阿霉素在臨床化療中的毒性反應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)線性關(guān)系,即隨著劑量的增加出現(xiàn)骨髓抑制、心臟毒性、脫發(fā)等毒副作用也愈加突出,尤其是嚴(yán)重的心臟毒性,可引起各種心律失常、充血性心力衰竭甚至死亡,因此大大限制了它的臨床使用。
   阿霉素引發(fā)心臟毒性的作用機(jī)制有多種學(xué)說,其中氧自由基學(xué)說被多數(shù)

2、研究者所認(rèn)同。阿霉素的氧自由基學(xué)說認(rèn)為,ADR進(jìn)入心肌細(xì)胞后,在微粒體中由還原型輔酶Ⅱ(NADPH)及細(xì)胞色素P450還原酶提供一個電子轉(zhuǎn)變?yōu)閹б粋€多余電子的半醌ADR,該半醌ADR又把此電子傳遞給氧分子(O2),使O2變成超氧陰離子(·O2-);在線粒體中由還原型輔酶Ⅰ(NADH)及NADH-氧化還原酶提供一個電子轉(zhuǎn)變?yōu)榘膈獳DR,并與O2作用產(chǎn)生·O2-,同時伴有過氧化氫(H2O2)生成增加?!2-與H2O2通過Haber-wei

3、ss反應(yīng)或Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基(·OH)。這些在心肌細(xì)胞中產(chǎn)生的氧自由基(OFR,包括·O2-、OH、H2O2)作用于細(xì)胞膜及各種細(xì)胞器膜上的磷脂中的多價不飽和脂肪酸,形成脂質(zhì)自由基,引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),使膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、扭曲,并影響膜上功能蛋白質(zhì)的位置及構(gòu)型,最終導(dǎo)致膜的完整性遭到破壞,膜的流動性降低,通透性增加,容量調(diào)節(jié)功能及離子轉(zhuǎn)運功能障礙,嚴(yán)重影響細(xì)胞的功能,造成心肌細(xì)胞損傷。
   氧自由基造成的心臟損傷作用

4、近年來被作為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。目前,在活體細(xì)胞中可標(biāo)記氧自由基并對其進(jìn)行實時監(jiān)測定量的指示劑種類還比較缺乏,尋找一種特異性高、靈敏、可進(jìn)行定量的氧自由基指示劑成為當(dāng)前研究的一大重點。2008年,北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所程和平教授研究組研究發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)胞超氧自由基生成事件,并命名為“超氧炫”(superoxide flashes),這是首次在活體細(xì)胞中觀測到局部、間歇性、量子化超氧的產(chǎn)生。超氧炫為線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔道(

5、mPTP)開放所觸發(fā),與線粒體電子傳遞鏈活性密切相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)是基于發(fā)明了一種新穎的高特異性超氧指示劑,即基因編碼的、定位于線粒體的可用于實時測量的熒光蛋白。
   本實驗擬就阿霉素導(dǎo)致心肌細(xì)胞早期損傷的氧自由基學(xué)說進(jìn)行研究,采用上述這種新型高特異性超氧指示劑“超氧炫”熒光蛋白,研究線粒體上氧自由基釋放是否是阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的早期事件,為阿霉素導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的氧自由基學(xué)說提供直接證據(jù),同時,對藥物所致細(xì)胞線粒體上超氧陰離子

6、生成情況進(jìn)行研究,為進(jìn)一步利用此種高特異性超氧指示劑建立藥物致心肌細(xì)胞損傷評價方法打下基礎(chǔ)。
   1新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及腺病毒轉(zhuǎn)染
   目的:建立新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法,完成“超氧炫”腺病毒的擴(kuò)增及轉(zhuǎn)染,為下一步實驗打下基礎(chǔ)。
   方法:(1)新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)取新生72小時內(nèi)的SD乳鼠,消毒,開胸,夾取心室部分,于冰浴的PBS液中洗滌,剪碎。消化6-8次后,過濾,離心,收集細(xì)胞,用培養(yǎng)液混懸,

7、差速貼壁80分鐘后,收集培養(yǎng)液中的非貼壁細(xì)胞,種于24孔板中,24小時后換培養(yǎng)基,然后每隔1天更換培養(yǎng)基1次。(2)“超氧炫”腺病毒的擴(kuò)增培養(yǎng)293A細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80%時,換液,加入腺病毒液,48-72小時后,當(dāng)有70-80%細(xì)胞變圓漂起時,收集病毒,-80℃/37℃反復(fù)凍融3次,離心,收集上清液。如此重復(fù)擴(kuò)增3輪。第四輪擴(kuò)增時,當(dāng)有50%細(xì)胞變圓漂起時,收集病毒,離心,棄去上清液,用1ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,-80℃/37℃

8、反復(fù)凍融3次,離心,收集上清液,分裝,-80℃儲存。(3)“超氧炫”腺病毒的滴度測定在6孔板中培養(yǎng)293A細(xì)胞,當(dāng)各孔細(xì)胞密度達(dá)到70-80%時,換液,加入稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的腺病毒液,沒加病毒的一孔細(xì)胞作對照。72h后選取剛好全部細(xì)胞變圓漂起或僅有少量細(xì)胞貼壁但細(xì)胞形態(tài)也已回縮的一孔,認(rèn)為此孔病毒的MOI值約為10。(4)“超氧炫”腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞向新生大鼠心肌細(xì)胞和成年大鼠心肌細(xì)胞中分別加入適量

9、的腺病毒,培養(yǎng)48-72h后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
   結(jié)果:
   (1)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察24 h后觀察細(xì)胞已基本全部貼壁,貼壁后為梭形或菱形,有一部分細(xì)胞已開始搏動。繼而細(xì)胞逐漸在皿底表面鋪展,并伸出偽足,形成不規(guī)則的星形并相互接觸交織成網(wǎng),在培養(yǎng)72 h后可形成呈放射狀排列的細(xì)胞簇,其搏動已同步化。
   (2)“超氧炫”腺病毒的滴度測定72 h后,對照孔的細(xì)胞已生長連接成片;10-1孔細(xì)

10、胞全部變圓漂起,懸浮在培養(yǎng)基中;10-2孔細(xì)胞絕大部分漂起,懸浮在培養(yǎng)基中,還有一小部分細(xì)胞貼壁,但細(xì)胞形態(tài)也已回縮;10-3孔和10-4孔細(xì)胞回縮變圓漂起、懸浮在培養(yǎng)基中的數(shù)量隨著加入病毒量的減少而減少,貼壁細(xì)胞隨之增加;10-5孔中幾乎沒有細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。故判定10-2孔病毒的MOI值約為10。
   (3)在激光共聚焦顯微鏡下觀察“超氧炫”腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡下可看到“超氧炫”腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的

11、效率很高,90%以上的心肌細(xì)胞均已被腺病毒感染,并表達(dá)其所攜帶的熒光蛋白,產(chǎn)生黃色熒光。
   結(jié)論:本實驗成功改進(jìn)了新生大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法及腺病毒的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染方法,使心肌細(xì)胞的成活率高,腺病毒的擴(kuò)增操作簡易、高效,為后續(xù)實驗打下了良好基礎(chǔ)。
   2阿霉素致心肌細(xì)胞氧自由基釋放的測定
   目的:以“超氧炫”熒光蛋白為指示劑,直接觀察阿霉素引起的心肌細(xì)胞氧自由基釋放情況。
   方法:(1)驗證“超

12、氧炫”熒光蛋白是否可作為心肌細(xì)胞線粒體上的超氧指示劑在激光共聚焦顯微鏡下連續(xù)觀察單個心肌細(xì)胞給蒼術(shù)苷(20μM)前后“超氧炫”熒光強度的變化。記錄細(xì)胞XYT平面內(nèi)給蒼術(shù)苷前后“超氧炫”熒光強度,并計算二者比值。(2)阿霉素致心肌細(xì)胞氧自由基釋放的測定在激光共聚焦顯微鏡下連續(xù)觀察單個心肌細(xì)胞給阿霉素(1.84μM)前后“超氧炫”熒光強度的變化。記錄細(xì)胞XYT平面內(nèi)給阿霉素前后不同時間點的“超氧炫”熒光強度,并分別計算給藥后不同時間點與給藥

13、前的熒光強度比值。
   結(jié)果:
   (1)驗證“超氧炫”熒光蛋白是否可作為心肌細(xì)胞線粒體上的超氧指示劑蒼術(shù)苷使心肌細(xì)胞給藥后300s的熒光強度平均增加到給藥前的111.08±3.63%(n=9),通過統(tǒng)計學(xué)分析可得,給藥后300s心肌細(xì)胞的“超氧炫”熒光強度比給藥前顯著增強(p<0.01)。由于蒼術(shù)苷是mPTP開放劑,可促使mPTP開放,線粒體跨膜電位降低,線粒體解聯(lián)的呼吸鏈產(chǎn)生大量活性氧,所以可以推斷“超氧炫”熒光

14、強度與心肌細(xì)胞線粒體上超氧陰離子的生成呈正相關(guān),進(jìn)而驗證了“超氧炫”熒光蛋白確實是一種定位于線粒體上可用于實時監(jiān)測的高特異性超氧指示劑。
   (2)阿霉素致心肌細(xì)胞氧自由基釋放的測定心肌細(xì)胞在給阿霉素后120s、300s、600s、1200s、1800s分別使其“超氧炫”熒光強度平均增加到給藥前的112.00±2.99、120.32±1.48、123.50±3.41、134.05±4.19、140.21±1.82%(n=6),

15、通過統(tǒng)計學(xué)分析可得,給藥后120s心肌細(xì)胞的熒光強度就比給藥前顯著增強(p<0.01),隨著時間的延長,其熒光強度逐漸增強。由于“超氧炫”熒光強度與心肌細(xì)胞線粒體上超氧陰離子的生成呈正相關(guān),所以可以推斷在本實驗所用給藥濃度的阿霉素作用下,給藥后120s心肌細(xì)胞線粒體上超氧陰離子生成顯著增多(p<0.01)。由于所用的阿霉素的給藥濃度是公認(rèn)的阿霉素造成急性心肌細(xì)胞中毒的濃度,所以可以認(rèn)為在本實驗中給阿霉素后會引起心肌細(xì)胞急性損傷中毒,因此

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