氧化損傷在低出生體重仔鼠發(fā)生代謝綜合征過(guò)程中的作用及干預(yù)研究.pdf

1、研究背景: 近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究均提示：低出生體重不僅是造成圍產(chǎn)兒死亡和發(fā)病的重要原因，而且還是成年后心血管疾病、糖代謝異常等代謝綜合征(MS)的獨(dú)立發(fā)病因素。因此研究低出生體重引起成年期MS的發(fā)病機(jī)制并實(shí)施相應(yīng)的干預(yù)來(lái)早期防治成年期疾病已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。 對(duì)低出生體重發(fā)生成年期MS的機(jī)制已進(jìn)行了一些研究，但其中機(jī)制并未完全明確。2型糖尿病是組成MS的主要疾病之一，它的主要發(fā)病機(jī)制包括胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功

2、能障礙。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氧化損傷在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，氧化損傷可以可以導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷并導(dǎo)致胰島素抵抗。氧化和抗氧化作用失衡所致的氧化損傷引起的胰島β細(xì)胞損傷是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。氧化損傷是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，氧自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御之間嚴(yán)重失衡，從而導(dǎo)致組織損傷，包括生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性、DNA損害，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡、疾病發(fā)生。在糖尿病早期，患者胰島附近的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)

3、物丙二醛(MDA)的濃度明顯增高，證實(shí)氧自由基在糖尿病的發(fā)病中起作用。目前對(duì)有關(guān)氧化損傷機(jī)制在低出生體重兒發(fā)生代謝綜合征的過(guò)程中是否發(fā)揮作用及其作用機(jī)制尚缺乏研究。從氧化損傷這一獨(dú)特視角來(lái)探討低出生體重兒在發(fā)生MS過(guò)程中的作用及機(jī)制并進(jìn)行相應(yīng)預(yù)防具有重要意義。 目的: (1)本實(shí)驗(yàn)給予孕鼠10％低蛋白飲食，制造低出生體重仔鼠模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)低出生體重仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況。 (2)動(dòng)態(tài)研究低出生體重仔鼠生后2～3月內(nèi)的

4、胰島功能與結(jié)構(gòu)的變化：包括血糖水平、血清胰島素水平、胰腺胰島素蛋白含量和β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，并根據(jù)血糖與血清胰島素值計(jì)算胰島β細(xì)胞分泌功能。 (3)研究低出生體重仔鼠體內(nèi)的氧化損傷狀態(tài)；并進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA與胰島β細(xì)胞功能之間的相關(guān)性研究，以揭示氧化損傷能否導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷。 (4)研究氧化損傷導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能與結(jié)構(gòu)改變的機(jī)制。 (5)探討L-精氨酸作為抗氧化營(yíng)養(yǎng)素對(duì)低出生體重仔鼠促生長(zhǎng)發(fā)育的影響；對(duì)

5、胰島細(xì)胞功能及結(jié)構(gòu)、對(duì)胰島素分泌的影響；進(jìn)一步從減輕過(guò)氧化損傷、促進(jìn)胰島素合成和分泌、減少胰島細(xì)胞凋亡及促進(jìn)胰島β細(xì)胞定向分化這幾個(gè)方面，揭示L-精氨酸影響低出生體重仔鼠胰島功能和結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制。 方法: (1)低出生體重仔鼠模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組：采用健康三月齡SD二級(jí)雌性和雄性大鼠各18只，按照雌雄1:1的比例同一籠中交配。 (2)低出生體重仔鼠胰島功能、結(jié)構(gòu)的檢測(cè)：在仔鼠生后7天、21天、2月齡或3月齡這幾個(gè)

6、時(shí)間點(diǎn)分別殺鼠取材，檢測(cè)以下指標(biāo)：①測(cè)體重，取血測(cè)空腹血糖及胰島素值；并根據(jù)公式計(jì)算胰島β細(xì)胞分泌功能。②取胰腺，用免疫組化法及WB方法分別檢測(cè)Insulin蛋白的表達(dá)及其水平。③制作胰腺電鏡標(biāo)本，電鏡下觀察胰島β細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 (3)低出生體重仔鼠氧化損傷狀態(tài)及抗氧化酶的檢測(cè)：①取血清檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA及抗氧化酶SOD、GSH-PX的水平。②制作胰腺勻漿、心肌勻漿及腦組織勻漿，分別檢測(cè)MDA、SOD及GSH-PX的水平。

7、③進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平與3月齡血糖值、胰島素蛋白水平和胰島β細(xì)胞分泌功能的相關(guān)性分析。 (4)氧化損傷機(jī)制對(duì)胰島功能、結(jié)構(gòu)影響的作用機(jī)制研究：①取胰腺，用免疫組化法及WB方法分別檢測(cè)NF-kB蛋白在胰腺中的表達(dá)及其水平。②采用RT-PCR方法檢測(cè)胰腺組織的Insulin、Bax及Bcl-2基因的mRNA表達(dá)。 (5)L-Arg干預(yù)后對(duì)低出生體重仔鼠生長(zhǎng)的影響及對(duì)胰島功能與結(jié)構(gòu)的影響和機(jī)制研究：①動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)仔鼠的體重

8、增長(zhǎng)情況；②測(cè)血糖及胰島素值，計(jì)算胰島β細(xì)胞分泌功能；③檢測(cè)血清MDA、SOD、GSH-PX及NO水平；④取胰腺，分別用免疫組化法和WB方法檢測(cè)Insulin蛋白、NF-kB蛋白及PDX-1蛋白的表達(dá)及其水平；⑤取胰腺，用RT-PCR法測(cè)Insulin、Bax及Bcl-2基因的mRNA表達(dá)；⑥電鏡下觀察胰島β細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組

9、間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。樣本間率的比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Bivariate直線相關(guān)分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。P<0.05視為差異有顯著性。 結(jié)果: (1)建立了低出生體重仔鼠模型：10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，可使其仔鼠出生體重下降，且較多達(dá)到IUGR的標(biāo)準(zhǔn)；而且每窩產(chǎn)仔數(shù)和圍產(chǎn)期死亡率較正常組無(wú)明顯差異。低出生體重仔鼠在生后2月內(nèi)體重一直低于正常組，但隨后出現(xiàn)快速的體重增加，生后3月齡時(shí)低出生體重仔鼠體重已

10、追趕上正常組。 (2)低出生體重仔鼠胰島功能、結(jié)構(gòu)的變化：①模型組3月齡時(shí)出現(xiàn)明顯的空腹高血糖癥。②正常組和模型組兩組間各時(shí)間點(diǎn)的血清胰島素水平無(wú)顯著性差異；但模型組在生后2月齡及3月齡時(shí)胰島β細(xì)胞分泌功能明顯弱于正常組。③各時(shí)間點(diǎn)的低出生體重仔鼠Insulin蛋白水平均顯著低于正常組；低出生體重仔鼠胰腺的Insulin mRNA的表達(dá)水平明顯低于正常組。④胰腺超微結(jié)構(gòu)顯示，低出生體重仔鼠生后2月齡時(shí)胰島β細(xì)胞的內(nèi)分泌顆粒明顯減

11、少，并出現(xiàn)脫顆粒和蒼白顆?，F(xiàn)象。 (3)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA及抗氧化酶的檢測(cè)：①各時(shí)間點(diǎn)的低出生體重仔鼠血清MDA值均顯著高于正常組；低出生體重仔鼠的血清SOD、GSH-PX值均顯著低于正常組。②檢測(cè)胰腺、心肌及腦組織勻漿亦有類似結(jié)果。 (4)氧化損傷狀態(tài)與胰島內(nèi)分泌功能之間的相關(guān)性：通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清及胰腺勻漿MDA值與大鼠生后3月齡血糖值之間存在明顯正相關(guān)；血清及胰腺勻漿MDA值與大鼠生后2月齡胰島素蛋白水平和

12、胰島β細(xì)胞分泌功能之間存在明顯負(fù)相關(guān)。 (5)氧化損傷機(jī)制對(duì)胰島功能、結(jié)構(gòu)影響的作用機(jī)制研究：①低出生體重仔鼠胰腺核因子NF-kB蛋白水平明顯高于正常組。②低出生體重仔鼠胰腺的抑制凋亡基因Bcl-2mRNA的表達(dá)水平明顯低于正常組；促凋亡基因BaxmRNA的表達(dá)水平高于正常組。 (6)L-Arg干預(yù)后對(duì)低出生體重仔鼠生長(zhǎng)及氧化損傷狀態(tài)的影響：①于生后早期給予L-Arg干預(yù)治療后，可使低出生體重仔鼠出現(xiàn)生長(zhǎng)追趕現(xiàn)象。至生后

13、21天、2月齡時(shí)，干預(yù)組的體重與正常組相比已無(wú)顯著性差異。②L-Arg干預(yù)治療后，可以使低出生體重仔鼠的血清MDA水平下降，并能增加血清SOD的含量。③正常組血清一氧化氮(NO)水平最高，模型組最低。L-Arg干預(yù)后能增加低出生體重仔鼠的血清NO水平，使其在生后21天及2月時(shí)接近正常組仔鼠的NO水平。 (7)L-Arg干預(yù)后對(duì)低出生體重仔鼠胰腺功能、結(jié)構(gòu)的影響和機(jī)制研究：①生后2月齡時(shí)，干預(yù)組大鼠胰島β細(xì)胞分泌功能較模型組有明顯

14、改善，已接近于正常組。②干預(yù)組大鼠在生后21天及2月時(shí)Insulin蛋白及InsulinmRNA表達(dá)水平較模型組均有明顯增加。③2月齡時(shí)，模型組PDX-1蛋白含量最低；L-Arg干預(yù)后可以促進(jìn)低出生體重仔鼠的PDX-1蛋白表達(dá)，使其接近于正常組水平。④模型組大鼠胰腺NF-kBp65蛋白的表達(dá)最強(qiáng)，正常組NF-kBp65蛋白的表達(dá)最弱；L-Arg干預(yù)后可以降低低出生體重仔鼠的NF-kBp65蛋白表達(dá)。⑤L-Arg干預(yù)可以上調(diào)大鼠胰腺Bcl

15、-2mRNA的表達(dá)，下調(diào)BaxmRNA的表達(dá)。⑥L-Arg早期干預(yù)后，可明顯增加低出生體重仔鼠的胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌顆粒，減少脫顆粒及蒼白顆?，F(xiàn)象。 結(jié)論: (1)10％低蛋白飼料喂養(yǎng)孕鼠，是一種有效的制造低出生體重仔鼠模型的方法。生后3月齡時(shí)，低出生體重仔鼠出現(xiàn)體重快速增加、空腹血糖值增高，有發(fā)生成年期代謝綜合征的傾向。 (2)生后2月齡及3月齡時(shí)，模型組大鼠的胰島p細(xì)胞分泌功能降低；Insulin蛋白及Insul

16、inmRNA水平低于正常組；出現(xiàn)胰島β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，表現(xiàn)為內(nèi)分泌顆粒明顯減少。提示低出生體重仔鼠存在胰島功能的損傷和超微結(jié)構(gòu)的改變。 (3)模型組大鼠體內(nèi)的過(guò)氧化損傷嚴(yán)重，抗氧化酶水平低下。相關(guān)性分析表明機(jī)體的氧化損傷狀態(tài)與其成年期高血糖癥之間具有顯著的正相關(guān)性，與機(jī)體的胰島素合成、分泌功能低下之間具有顯著的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明氧化損傷導(dǎo)致了胰島β細(xì)胞的功能受損。提示氧化損傷機(jī)制在低出生體重仔鼠發(fā)生成年期代謝綜合征的過(guò)程中起重要

17、作用。 (4)低出生體重仔鼠存在NF-kBp65蛋白水平升高，并出現(xiàn)促凋亡基因BaxmRNA表達(dá)的增強(qiáng)和抑凋亡基因Bcl-2mRNA表達(dá)的減弱。提示氧化損傷對(duì)胰島功能和結(jié)構(gòu)的影響與NF-kB蛋白的激活、Bcl-2/Bax平衡的改變而導(dǎo)致的胰島細(xì)胞凋亡增多有關(guān)。 (5)生后早期補(bǔ)充L-Arg對(duì)低出生體重仔鼠具有促生長(zhǎng)追趕的作用。 (6)生后早期補(bǔ)充L-Arg可以通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶SOD的活性和增加血清NO的水平來(lái)減輕