葛根總黃酮誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡與JNK相關(guān)信號(hào)分子.pdf

1、[背景與目的]
　　葛根總黃酮是中藥葛根的主要有效成分之一，近5年來(lái)，課題組研究發(fā)現(xiàn)葛根總黃酮(Puerariae radix flavones，PRF)在12.5～200μg/ml對(duì)不同急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細(xì)胞株（HL-60、Kasumi-1、NB4和U937）有選擇性抑制作用，以NB4細(xì)胞最強(qiáng)，并影響上述細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，阻滯細(xì)胞于S期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明上述劑量PR

2、F可以延長(zhǎng)NB4細(xì)胞異種移棺瘤裸鼠的生存周期，抑制移植瘤裸鼠的生存周期、抑制移植瘤瘤體的增長(zhǎng)。課題組進(jìn)一步選用更低濃度PRF（0～50μg/ml）干預(yù)NB4細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)較低劑量PRF便能有效抑制NB4細(xì)胞株增殖，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，阻滯細(xì)胞于S期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)證明PRF體外誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡時(shí)，JNK蛋白活化，caspase3和caspase8上調(diào)，p38MAPK表達(dá)下調(diào)。在此基礎(chǔ)上，本研究以NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)JNK抑制劑sp

3、600125阻斷JNK信號(hào)分子，檢測(cè)0～50μg/mlPRF對(duì)NB4細(xì)胞凋亡的影響及JNK下游相關(guān)信號(hào)分子的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證JNK信號(hào)通路在PRF誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡中可能的作用或地位
　　[方法]
　　1、0、10、30、50μg/ml PRF作用于NB4細(xì)胞24、48及72小時(shí)，MTT法檢測(cè)NB4細(xì)胞的增殖抑制率
　　2、0、10、30、50μg/ml PRF作用于NB4細(xì)胞48小時(shí)，瑞氏染色觀察NB4細(xì)胞形態(tài)學(xué)變

4、化
　　3、0、10、30、50μg/ml PRF作用于NB4細(xì)胞48小時(shí)，F(xiàn)ITC-Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率改變
　　4、0、10、30、50μg/ml PRF±10μmol/L sp600125作用于NB4細(xì)胞48小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程、線粒體膜電位變化
　　5、0、10、30、50μg/ml PRF±10μmol/L sp600125作用于NB4細(xì)胞48小時(shí)，蛋白印記法檢測(cè)JNK

5、通路相關(guān)蛋白改變
　　[結(jié)果]
　　1、PRF對(duì)NB4細(xì)胞有增殖抑制作用
　　10、30、50μg/mlPRF能夠抑制NB4細(xì)胞增殖，呈濃度-時(shí)間依賴性。PRF干預(yù)NB4細(xì)胞24、48、72hIC50分別為28.81、17.17、8.33μg/ml。
　　2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變
　　0～50μg/ml PRF干預(yù)NB4細(xì)胞48h，隨濃度增加，瑞氏染色示凋亡特征逐漸明顯。
　　3、細(xì)胞凋亡率改變
　　

6、0～50μg/ml PRF干預(yù)NB4細(xì)胞48h，流式細(xì)胞術(shù)提示早期凋亡率隨濃度升高而增加，10、30、50μg/ml PRF組早期凋亡率分別為6.2％、23.1％、37.1％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、細(xì)胞周期改變
　　0～50μg/ml PRF作用于NB4細(xì)胞48h后，細(xì)胞阻滯于S期，呈典型的凋亡改變。JNK抑制劑sp600125與PRF共同干預(yù)NB4細(xì)胞48h后，PRF雖仍可影響細(xì)胞周期進(jìn)程，但S期細(xì)胞數(shù)較單藥組減少。<

7、br>　　5、線粒體膜電位改變
　　0～50μg/ml PRF作用NB4細(xì)胞48h，流式細(xì)胞術(shù)定性分析提示線粒體膜電位隨著濃度升高而降低;JNK特異性抑制劑sp600125與PRF共同干預(yù)NB4細(xì)胞48h后，較之各PRF單藥組，線粒體膜電位升高，較之SP600125單藥組，線粒體膜電位隨著PRF濃度升高而降低。
　　6、PRF影響NB4細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)
　　NB4細(xì)胞在PRF干預(yù)48小時(shí)后，隨著細(xì)胞凋亡的增加

8、，JNK、p-JNK、ERK、Fas、cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)，p38、Bcl-2、pro-caspase9、pro-caspase3表達(dá)下調(diào)，而p53在10μg/mlPRF組表達(dá)上調(diào)，30、50μg/ml組表達(dá)下調(diào)，cyto-c在10μg/mlPRF組表達(dá)下調(diào)，30、50μg/ml組表達(dá)上調(diào)，cleaved caspase-8在10μg/mlPRF組表達(dá)下調(diào)，30μg/ml組無(wú)明顯變化，在50μg/ml表達(dá)上調(diào)，JN

9、K抑制劑sp600125與PRF共同干預(yù)NB4細(xì)胞48小時(shí)后，較之單藥組JNK、p-JNK、ERK、p38、p53、Fas、cyto-c、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3表達(dá)受抑制，Bcl-2表達(dá)增加，而pro-caspase3、pro-caspase9在10μg/mlPRF組表達(dá)受抑制，30、50μg/ml組表達(dá)增加。本研究未檢測(cè)到p-p53表達(dá)。
　　[結(jié)論]
　　較低濃度PRF能有