重組pEgr-Endostatin-EGFP質(zhì)粒的輻射誘導(dǎo)特性及其在基因-放射治療中的應(yīng)用.pdf

1、[背景與目的]在腫瘤的治療中,將治療性的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或正常組織,逐漸成為腫瘤治療研究的重要策略之一。然而,由于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),轉(zhuǎn)基因的表達(dá)對(duì)于腫瘤的靶向性及調(diào)節(jié)的局限性,使得實(shí)驗(yàn)室的觀察結(jié)果難以應(yīng)用于臨床實(shí)踐。最近有研究表明,腫瘤的基因治療與其它種類的治療方式結(jié)合后,可獲得明顯的基因治療效果。早期生長反應(yīng)基因Egr-1(early growth response gene-1)將腫瘤的基因治療與放射治療有機(jī)地結(jié)合起來,為腫瘤的基因治療

2、提供了一個(gè)新的應(yīng)用前景。內(nèi)皮抑素,最初由小鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞系分離純化得來的,由膠原ХVⅢC末端單基因片段編碼的小約20-kDa肽段組成,位于血管的基因膜區(qū)域。在細(xì)胞水平上,內(nèi)皮抑素特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。到目前為止,內(nèi)皮抑素是當(dāng)今在活體內(nèi),最有效的血管生成內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤生長的特異性抑制劑之一。因此在本研究中,我們構(gòu)建了pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒,檢測(cè)其輻射誘導(dǎo)特性,評(píng)價(jià)內(nèi)皮抑素基因治療結(jié)合

3、局部X線照射治療腫瘤的效果,目的在于,評(píng)價(jià)基因-放射聯(lián)合治療與單一的基因治療或放射治療相比,是否能顯著地提高腫瘤的治療效果
　　[材料與方法]1)材料:①pIRES2-EGFP質(zhì)粒, pcDNA3.1-Egr質(zhì)粒, pMD18T-Endostatin質(zhì)粒;②小鼠 B16黑色素瘤細(xì)胞;③C57BL/6成年雌性小鼠。2)方法:構(gòu)建pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒,通過限制酶切反應(yīng)及PCR技術(shù)鑒定質(zhì)粒是否構(gòu)建成功;采用脂

4、質(zhì)體將 pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)入小鼠 B16黑色素瘤細(xì)胞,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮抑素基因的表達(dá),運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá)。荷瘤小鼠注射重組pEgr-Endostatin-EGFP質(zhì)粒后,給予2 Gy X線照射,間隔48 h照射3次,腫瘤的生長在給予處理后18 d觀察,腫瘤血管的生成則通過免疫組織化學(xué)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
　　[結(jié)果]通過限制性內(nèi)切酶反應(yīng)與PCR技術(shù)證實(shí),pE

5、gr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒已構(gòu)建成功,在小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染該重組質(zhì)粒并接受X線輻射之后,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)證實(shí),在正常小鼠 B16黑色素瘤細(xì)胞中沒有特異性的內(nèi)皮抑素條帶,但在轉(zhuǎn)染pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒的各組中,無論黑色素瘤細(xì)胞是否給予 X線輻射,均可檢測(cè)到內(nèi)皮抑素的陽性條帶。轉(zhuǎn)染 pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒的黑色素瘤細(xì)胞給予0.05~20 Gy的X線照射以后,均

6、可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。時(shí)程研究顯示,轉(zhuǎn)染pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒的黑色素瘤細(xì)胞,在給予2 Gy X線照射8 h后,綠色熒光蛋白的表達(dá)達(dá)到峰值。將pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒注射到C57BL/6J黑色素瘤荷瘤小鼠瘤體內(nèi),腫瘤的生長及腫瘤內(nèi)微血管密度顯著的受到了抑制。
　　【結(jié)論】本研究成功構(gòu)建pEgr-Endostatin-EGFP重組質(zhì)粒,體外研究發(fā)現(xiàn),Endostatin基因結(jié)合