GV143-EGFP-ECAD和pIRES2-EGFP-ECAD兩種質(zhì)粒在腹膜間皮細胞中的表達.pdf

1、目的:
　　以GV143-EGFP-ECAD和pIRES2-EGFP-ECAD兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染腹膜間皮細胞，并評估轉(zhuǎn)染效率及E-caherin在腹膜間皮細胞中的過表達。
　　方法:
　　(1)以E-cadherin-pcDNA3為基因模板，pIRES2-EGFP、GV143-EGFP為基因載體，分別構(gòu)建pIRES2-EGFP-ECAD和GV143-EGFP-ECAD表達載體。將目的基因E-cadherin(ECAD E

2、-鈣粘蛋白)和基因載體（pIRES2-EGFP and GV143-EGFP）進行雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞擴增，利用重組體抗性篩選陽性克隆，陽性克隆細胞進行擴增和提取、酶切鑒定、測序驗證。
　　(2)采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法用兩種基因模板分別轉(zhuǎn)染腹膜間皮細胞株（HMrSV5），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分組為轉(zhuǎn)染0h、24h、36h、48h、72h組。
　　(3)在熒光顯微鏡下觀察表達EGFP（增強型綠色熒光蛋白）的細胞數(shù)

3、，并計算轉(zhuǎn)染效率。
　　(4) HMrSV5細胞株轉(zhuǎn)染后提取各組細胞總RNA，采用RealTime PCR檢測各組細胞E-cadherin mRNA的表達水平。采用Western blot及間接免疫熒光檢測各組E-cadherin蛋白的表達水平，及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組E-cadherin和α-SMA的表達水平
　　結(jié)果:
　　(1)構(gòu)建的pIRES2-EGFP-ECAD、GV143-EGFP-ECAD質(zhì)粒經(jīng)測序分析證實，質(zhì)粒序

4、列無突變，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后電泳鑒定，顯示pIRES2-EGFP-ECAD2條帶分別在2.6K和5.4K的位置，GV143-EGFP-ECAD電泳結(jié)果顯示酶切后2條帶分別在4.8K、2.6K左右，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　(2)以表達EGFP的細胞數(shù)評估轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染GV143-EGFP-ECAD的細胞僅見36h、48h有少數(shù)幾個細胞表達EGFP，24h、72h均未見表達。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-ECAD的細胞提示轉(zhuǎn)染后24h

5、、36h、48h、72h均可見EGFP表達，36h時表達EGFP的細胞最多，計算轉(zhuǎn)染效率分別為:18％、58％、41％、15％。
　　(3) Real TimePCR結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染兩種ECAD質(zhì)粒后，ECAD mRNA表達較上調(diào)，24小時達到高峰，36h、48h、72h較24h呈時間依賴性下降，但仍高于0h組。Western blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染24小時后，分別使用兩組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腹膜間皮細胞E-cadherin蛋白表達均在24小