egfp在集胞藻6803中克隆及其表達調控研究.pdf

1、自1968年藍藻被證實具有遺傳重組現(xiàn)象開始，越來越多的人致力于藍藻基因工程研究。隨著藍藻基因工程的發(fā)展，有一批外源基因被導入到藍藻中表達。主要涉及環(huán)境治理、代謝調控、營養(yǎng)保健品和基因工程藥物表達等應用領域。但是，外源基因表達效率低下的瓶頸制約了藍藻基因工程的發(fā)展，無法實現(xiàn)規(guī)?；a應用。 影響基因表達的因素有很多。如：基因拷貝數(shù)、密碼子偏好性、啟動子、終止子、反義RNA技術以及蛋白表達策略等。本研究試圖從選擇啟動子、改變SD序列

2、入手，對改進藍藻外源基因表達系統(tǒng)和提高外源基因表達效率做一些探討。 集胞藻6803(Synechocystis sp.strain PCC6803)是一種單細胞藍藻，具有生長速度快、培養(yǎng)條件簡單、不產生毒素、細胞結構簡單、遺傳背景清楚、方便分子操作等的特點，在特殊培養(yǎng)條件下還可以進行異養(yǎng)生長，非常適合于利用光合生物反應器大規(guī)模生產。因此，集胞藻6803是種很好的藍藻基因工程受體。 本研究選擇集胞藻6803染色體DNA中c

3、upA基因及其下游相連的兩個片段分別作為上游整合平臺(up)和下游整合平臺(down)，在二者間插入誘導型高效啟動子、egfp(增強型綠色熒光蛋白基因)報告基因、卡那霉素抗性篩選標記，構建得到集胞藻6803同源重組雙交換整合平臺。 在整合平臺的基礎上，通過更換啟動子和進行SD序列距離修飾，共得到6個帶啟動子和1個不帶啟動子的轉化載體。把轉化載體分別自然轉化到野生型集胞藻6803中，經卡那霉素篩選得到7個轉基因藻。它們分別含有能夠

4、被紅光誘導的Popeβ(轉pK-Pcpcβ集胞藻6803和轉pK-Pcpcβ2集胞藻6803)、被溫度誘導的PgroESL(轉pK-PgroESL，集胞藻6803和轉pK.PgroESL2集胞藻6803)、被光照誘導的PpsbA(轉pK-PpsbA集胞藻6803和轉pK-PpsbA2集胞藻6803)和1個不帶啟動子的轉pK-P0集胞藻6803。 根據啟動子的不同誘導特性，分別設計梯度誘導條件誘導EGFP表達，通過檢測EGFP(增