集胞藻PCC6803高效合成三羥基丙酸(3-HP)及其對異源途徑代謝響應(yīng)機制的研究.pdf

1、作為一種重要的平臺化合物，三羥基丙酸(3-HP)的應(yīng)用非常廣泛。目前三羥基丙酸主要是依靠化學(xué)合成的方法進行生產(chǎn)，這將對環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生不利影響。藍細(xì)菌擁有可以直接固定CO2的能力，使其成為適合燃料以及化學(xué)品生產(chǎn)的自養(yǎng)型微生物“細(xì)胞工廠”。在本研究中，我們在藍細(xì)菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中構(gòu)建了三羥基丙酸的生物合成途徑，并通過以下方法對該生物合成系統(tǒng)進行了優(yōu)化:1）使用不同啟動子提高丙二酰輔酶A還原酶

2、(MCR)基因表達量以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化;2）過表達乙酰輔酶A羧化酶和生物素?；富蛱岣咔绑w物丙二酰輔酶A產(chǎn)量;3）過表達NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶基因改善NADPH供應(yīng);4）通過敲除PHA以及乙酸合成競爭通路使得碳源更多的流入3-HP合成通路。通過優(yōu)化，經(jīng)過6天的培養(yǎng)Synechocystis中3-HP產(chǎn)量可以達到837.18mg L-1(348.8mg/g細(xì)胞干重)。另外，過表達來自魚腥藻Anabaena sp.PCC7120和聚球藻Syn

3、echococcus sp.PCC7942中核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因并沒有增加3-HP產(chǎn)量，這表明CO2固定也許并不是影響3-HP的生物合成的主要因素。
　　目前對于藍細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部3-HP生物合成對代謝的響應(yīng)機制的研究尚無報道。為此，在Synechocystis中成功構(gòu)建了3-HP代謝通路后，我們利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)與液相二級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(iTRAQ-LC-MS/MS)對3-HP生產(chǎn)株與野生型中蛋白表達

4、譜進行了比較。經(jīng)過比對，蛋白組分析共檢出2，264個獨立蛋白，占Synechocystis基因組預(yù)測蛋白總數(shù)的63％。在所有檢測到的蛋白中上調(diào)蛋白為204個，下調(diào)蛋白為123個。我們還利用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對細(xì)胞內(nèi)24種重要中心代謝物進行了檢測，綜合蛋白組學(xué)與代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)可以看出Synechocystis中有關(guān)光合作用，氧化磷酸化作用，中心碳代謝過程的蛋白質(zhì)以及轉(zhuǎn)運結(jié)合蛋白，蛋白翻譯過程，細(xì)胞調(diào)控過程的蛋白以及中心碳

5、代謝過程中24種重要代謝物中有14種代謝物上調(diào)。綜合蛋白組和代謝組的數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)向集胞藻中引入外源3-HP合成途徑后，由于大量生產(chǎn)3-HP，細(xì)胞需要通過代謝調(diào)控機制對系統(tǒng)內(nèi)所消耗的前體物以及能量、還原力進行補充，并通過自我調(diào)節(jié)降低3-HP產(chǎn)生毒性的影響，以保證了細(xì)胞在正常生長。我們還通過RT-qPCR分析和相關(guān)基因的過表達對蛋白組數(shù)據(jù)以及代謝調(diào)控機制進行了驗證，結(jié)果進一步證明了蛋白組數(shù)據(jù)的可靠性以及機理分析的準(zhǔn)確性。通過對3-HP生產(chǎn)株