12728.集胞藻pcc6803多不飽和脂肪酸生物合成關(guān)鍵酶復(fù)合體的研究

1、集胞藻集胞藻PCC6803多不飽和多不飽和脂肪酸脂肪酸生物合成生物合成關(guān)鍵酶復(fù)合體的研究關(guān)鍵酶復(fù)合體的研究ProteincomplexesrelatedtopolyunsaturatedfattyacidbiosynthesisinSynechocystissp.PCC6803領(lǐng)域：生物工程研究生：巫琴指導(dǎo)教師：張衛(wèi)文教授企業(yè)導(dǎo)師：王冰高級(jí)研究員天津大學(xué)化工學(xué)院二零一四年五月摘要細(xì)胞的代謝活動(dòng)依賴于胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的活性，而胞內(nèi)蛋白質(zhì)大多

2、是以蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在。蛋白質(zhì)復(fù)合體在諸如生物催化、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫、細(xì)胞調(diào)控等多種生命過程起著重要的作用。目前，對(duì)藍(lán)藻中多不飽和脂肪酸相關(guān)代謝和調(diào)控途徑的蛋白質(zhì)作用機(jī)制的知識(shí)十分缺失，限制了將這類高效代謝和調(diào)控模塊用于大幅度提高多不飽和脂肪酸產(chǎn)量的各種努力。為了大規(guī)模合成這種重要的高附加值生物產(chǎn)品，我們?cè)诩錚CC6803中發(fā)展蛋白質(zhì)復(fù)合體分析技術(shù)，并利用這一技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和鑒定多不飽和脂肪酸生物合成關(guān)鍵酶復(fù)合體的重要功能化

3、伴侶蛋白，以完善對(duì)相關(guān)生物功能模塊的認(rèn)識(shí)。我們的科學(xué)研究假說是這些和重要脂肪酸合成酶共存于同一蛋白復(fù)合體中的功能伴侶蛋白也可能有著重要的生物學(xué)功能。在本文中，首先選取了與多不飽和脂肪酸合成相關(guān)的slr1609、sll0617、slr1137三個(gè)基因，通過在集胞藻PCC6803中構(gòu)建含有3FLAG尾部的重組蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了選定的脂肪酸關(guān)鍵合成酶的突變重組，突變體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證均正確。然后，從中挑選出在脂肪酸代謝中起樞紐作用的脂肪酸激活酶基因sl

4、r1609的突變株作為研究對(duì)象，利用RTqPCR技術(shù)優(yōu)化了重組蛋白表達(dá)條件，并通過SDSPAGE和Western雜交，對(duì)3FLAG標(biāo)記的slr1609突變株進(jìn)行了鑒定。根據(jù)slr1609的亞細(xì)胞定位，分別提取全細(xì)胞與細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，利用標(biāo)簽標(biāo)記親和純化技術(shù)分離純化出蛋白質(zhì)復(fù)合體，并通過NativePAGE初步驗(yàn)證了蛋白質(zhì)復(fù)合體的存在。最后，利用LCMSMS分別鑒定了slr1609突變株的全細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)中目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合體成分，質(zhì)譜結(jié)果表

5、明目標(biāo)蛋白能正常表達(dá)且被純化，同時(shí)我們獲得了三個(gè)可能與脂肪酸代謝有關(guān)的未知功能蛋白——Sll0350、Ssl1707和Sll0981，對(duì)于鑒定到的蛋白質(zhì)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證來提供更有力的證據(jù)，利用分子生物學(xué)手段和組學(xué)手段對(duì)有效候選伴侶蛋白進(jìn)行功能研究。本研究一方面立足于建立重要的分析方法，另一方面對(duì)有著重要合成生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值的藍(lán)細(xì)菌脂肪酸合成途徑進(jìn)行研究，研究手段和結(jié)果具有很高的創(chuàng)新性。對(duì)脂肪酸代謝途徑的研究將有利于對(duì)這一途徑相關(guān)產(chǎn)品