集胞藻PCC6803基因sll0853的初步研究.pdf

1、2004年,Shen G等在Synechococcus PCC7002中發(fā)現(xiàn)裂合酶編碼基因cpcS、cpcT、cpcU和cpcV,這些基因所編碼的蛋白質(zhì)能催化藻膽色素和藻膽蛋白脫輔基的結(jié)合。通過(guò)同源分析軟件發(fā)現(xiàn)基因sll0853與cpcS具有較高的同源性,本文針對(duì)基因sll0853是否具有裂合酶的功能進(jìn)行研究,主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　1)提取PCC6803的DNA,基因sll0853PCR擴(kuò)增,獲得目的基因,構(gòu)建克隆載體T-085

2、3和表達(dá)載體pET-0853,利用生物信息學(xué)軟件分析基因sll0853的蛋白結(jié)構(gòu),并通過(guò)軟件預(yù)測(cè)目的蛋白分子大小,SDS-PAGE蛋白電泳進(jìn)行鑒定,對(duì)sll0853基因表達(dá)蛋白在不同誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和IPTG濃度條件下優(yōu)化。
　　2)將兩個(gè)基因 sll0853與 cpcB共同連接至一個(gè)共表達(dá)載體 pACYCDuet-1中,因?yàn)檩d體pACYCDuet-1有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)域,每個(gè)多克隆區(qū)域都有一個(gè)T7啟動(dòng)子,可以連接兩個(gè)目的基因,共同

3、表達(dá),構(gòu)建重組載體pACYC-cpcB-0853。pET-ho1-pcyA表達(dá) PCB,為本實(shí)驗(yàn)室保存。為了使重組體系的共表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到最大值,分別對(duì)兩個(gè)重組載體蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　3)將pACYC-cpcB-0853和pET-ho1-pcyA共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中,對(duì)重組體系pACYC-cpcB-0853+pET-ho1-pcyA的共表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳和紫外熒光光譜測(cè)定,驗(yàn)證基因sll0853是否具有裂

4、合酶的功能。
　　4)為了確定sll0853基因的功能,構(gòu)建缺失基因sll0853的突變株。將sll0853基因片段敲除替換成卡那霉素抗性基因片段,將構(gòu)建好的含卡那抗性重組質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入集胞藻 PCC6803中,利用卡那霉素抗性篩選,得出同源重組成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,突變?cè)宸N培養(yǎng),對(duì)突變株與野生株在BG11培養(yǎng)基和不同光照強(qiáng)度下的OD值,繪制曲線,進(jìn)行比較。
　　從NCBI上找到基因sll0853,此基因?yàn)槲粗δ芑?首先對(duì)

5、基因進(jìn)行克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建,在對(duì)目的基因的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè),分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白可能具有色素裂合酶作用或者與裂合酶相似的功能。利用分析的蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)Sll0853蛋白表達(dá),表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件,結(jié)果表明在28℃、0.2 mM IPTG、誘導(dǎo)6 h蛋白表達(dá)量最大,為蛋白純化提供了條件;其次構(gòu)建重組體系研究基因sll0853的裂合酶功能,為了使重組體系的蛋白表達(dá)量最大,所以對(duì)兩個(gè)重組載體進(jìn)行了蛋白

6、優(yōu)化,這是本文的創(chuàng)新點(diǎn),結(jié)果表明:22℃、0.2 mM IPTG、誘導(dǎo)5 h重組質(zhì)粒pACYC-cpcB-0853的蛋白表達(dá)量最大;22℃、0.6 mM IPTG重組質(zhì)粒pET-hol-pcyA的蛋白表達(dá)量最大,電泳還表明pET-hol-pcyA在不同時(shí)間的蛋白表達(dá)量差別不大。但是對(duì)重組體系的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE蛋白電泳和紫外熒光光譜測(cè)定,蛋白電泳圖譜在相應(yīng)的位置并無(wú)條帶出現(xiàn),熒光光譜在620 nm處也無(wú)顯示,初步斷定表明基因