睪丸內(nèi)注射轉(zhuǎn)染EGFP基因及其在精子中表達(dá)的研究.pdf

1、背景和目的：目前實(shí)驗(yàn)室制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物常用方法仍然是原核顯微注射法。但該方法需要使用昂貴的顯微注射儀，技術(shù)要求較高，外源基因整合率低，整合有較大的隨機(jī)性。此外，犬等動(dòng)物卵母細(xì)胞或受精卵胞漿中富含脂質(zhì)，在顯微鏡下不易看到原核，使此技術(shù)在一定程度上受到了限制。因此，為了制備轉(zhuǎn)基因犬，我們以雄性動(dòng)物為對(duì)象，運(yùn)用雄性配子的生精與遺傳原理，采用睪丸內(nèi)直接注射法，制備通過(guò)精原干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。利用精原干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作的一條

2、嶄新途徑，特別是對(duì)那些人工難以調(diào)控繁殖活動(dòng)動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因研究具有十分重要的意義。 方法：通過(guò)探討不同年齡、不同注射方法和不同注射量對(duì)轉(zhuǎn)染后小鼠的生殖能力的影響，挑選合適年齡小鼠用于轉(zhuǎn)基因研究。通過(guò)冰凍切片和PCR檢測(cè)，觀察小鼠EGFP基因整合情況。 在對(duì)小鼠睪丸內(nèi)注射法優(yōu)化的基礎(chǔ)上，我們以畢格犬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討了不同量的DNA轉(zhuǎn)染后對(duì)精液品質(zhì)、睪丸組織的影響，以及轉(zhuǎn)染后在睪丸組織和精子中的表達(dá)情況，以篩選出最合適的注射

3、劑量。研究睪丸內(nèi)直接注射法的可行性，優(yōu)化睪丸內(nèi)注射法。 結(jié)果：通過(guò)對(duì)5周齡和7周齡小鼠注射EGFP基因，發(fā)現(xiàn)注射后，7周齡小鼠的存活率和平均產(chǎn)仔數(shù)優(yōu)于5周齡小鼠。提示7周齡的小鼠為實(shí)驗(yàn)的最佳年齡。我們將實(shí)驗(yàn)小鼠的一側(cè)輸精管結(jié)扎不注射外源基因，僅注射未結(jié)扎一側(cè)睪丸，發(fā)現(xiàn)結(jié)扎、單側(cè)睪丸注射小鼠的生殖能力優(yōu)于不結(jié)扎的雙側(cè)注射小鼠。研究采用40μl和60μl基因轉(zhuǎn)染液注射小鼠睪丸，發(fā)現(xiàn)60μl的轉(zhuǎn)染液，使睪丸內(nèi)的壓力變得很大，轉(zhuǎn)染液從

4、注射孔中流出，也對(duì)睪丸造成一定程度的損傷，使它的存活率、配種率和平均產(chǎn)仔數(shù)均低于40μl劑量組。取18只小鼠在注射后20天，每隔5天取睪丸組織，每次取三個(gè)樣，共取6次。通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)冰凍切片觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠的睪丸中精原干細(xì)胞有EGFP基因表達(dá)。 選取10只性欲旺盛的2-3歲的畢格公犬，分成5組，每組兩只(一只用于精液采集，另一只用于冰凍切片的制作)，一側(cè)結(jié)扎，分別對(duì)未結(jié)扎側(cè)注射200μg、300μg.400μg、500μg、6

5、00μg五種不同劑量的DNA(一次)，每隔四天注射一次，共注射三次。經(jīng)50，60，70，80天收集精液，進(jìn)行精液品質(zhì)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示200μg、300μg處理劑量組，犬的精液品質(zhì)與處理前相比沒(méi)有明顯變化。而400μg、500μg、600μg處理劑量組，特別是500μg、600μg處理劑量組犬的平均精液射精量、密度、活力和外觀色澤與處理前相比，下降比較明顯。對(duì)收集的精液熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在注射400μg劑量質(zhì)粒的犬(W219)，在注射后

6、60-70天時(shí)收集的鮮精有微弱的EGFP表達(dá)，其余樣本均未見(jiàn)EGFP表達(dá)。睪丸內(nèi)注射30天后，每組劑量各取一只犬的睪丸制作冰凍切片，和未注射的正常犬的睪丸比較，結(jié)果顯示500μg、600μg劑量，對(duì)犬睪丸組織有一定的損傷，曲細(xì)精管呈散在狀。通過(guò)熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，400μg劑量組睪丸中精原干細(xì)胞有EGFP基因表達(dá)，綜上所述，得出400μg劑量是犬睪丸內(nèi)注射的最適劑量。 結(jié)論：本研究針對(duì)可能影響犬和小鼠睪丸內(nèi)注射介導(dǎo)EGFP基因