基因重組工具在腫瘤學研究中的應用.pdf

1、腫瘤已成為全球首要致死原因，給人類社會帶來了沉重的疾病負擔。深入具體地認識腫瘤發(fā)生的分子機制，將極大地協(xié)助大家精準地治療腫瘤，提高患者生活質(zhì)量和生存時間。作為一種基因組不穩(wěn)定的體細胞遺傳病，腫瘤之間存在很大異質(zhì)性，并且本身處于不斷“進化”的狀態(tài)，這些特性使得鑒定、驗證更多腫瘤相關基因，并實現(xiàn)靶向治療，依然是一件充滿挑戰(zhàn)的研究工作。
　　本博士學位論文包括以下三項研究:
　　1、為發(fā)現(xiàn)更多腫瘤抑制基因，我們設計并開展了利用轉(zhuǎn)座

2、子在小鼠體內(nèi)篩選腫瘤抑制基因的工作。在Blm缺失背景的小鼠體內(nèi)，我們利用piggyBac轉(zhuǎn)座子介導體細胞發(fā)生插入突變，干擾基因正常功能，從而誘發(fā)腫瘤生長。接著，我們收集了腫瘤標本，提取腫瘤基因組DNA，利用piggyBac序列標簽克隆突變位點，并分析篩選的候選腫瘤基因。我們發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)高頻次的轉(zhuǎn)座可以導致小鼠胚胎致死;中等頻率的轉(zhuǎn)座會引起小鼠出生后生長發(fā)育異常;即使低頻次的轉(zhuǎn)座也會使小鼠整體生存周期縮短，并誘發(fā)腫瘤。在克隆piggyB

3、ac插入位點之后，我們可以看到，相比小鼠尾巴中轉(zhuǎn)座子的整合，腫瘤標本中piggyBac插入位點存在明顯的富集現(xiàn)象，提示腫瘤克隆擴增特性;piggyBac插入位點數(shù)量及其分布與已有研究比較一致;然而，在目前有限的腫瘤標本及測序分析中，我們尚未發(fā)現(xiàn)明確的腫瘤抑制基因。本課題的開展，提示我們利用piggyBac在體篩選腫瘤相關基因是可行;當然，為使研究更深入，限定篩選腫瘤的類型并完善相關專業(yè)條件也需要考慮。
　　2、為研究Cdk5rap

4、3在小鼠肝細胞癌發(fā)生中的作用，我們在肝細胞特異的Cdk5rap3條件性敲除小鼠中，利用DEN誘發(fā)肝細胞癌的生長，通過與野生型小鼠觀察比較肝癌發(fā)生率及腫瘤生長狀態(tài)，明確該基因缺失對肝癌發(fā)生的影響。觀察發(fā)現(xiàn)，肝細胞特異地敲除Cdk5rap3顯著提高了小鼠肝癌發(fā)生率，其腫瘤生長數(shù)量和質(zhì)量均遠遠高于野生型小鼠;讓人意外的是，病理分析發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中Cdk5rap3表達明顯升高，這些細胞并非來自基因敲除的肝細胞。這些結(jié)果提示我們，條件性敲除部分肝細

5、胞中Cdk5rap3可以顯著提高小鼠肝細胞癌易感性;這一表型的改變更多地來自肝臟內(nèi)細胞與細胞或細胞與微環(huán)境之間的相互作用。
　　3、我們利用全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)在Flt3-ITD敲入小鼠中存在一個耐藥變異(Flt3-ITDc.2076T＞A)。為驗證該變異會引起腫瘤細胞耐藥，我們克隆了cDNA，并將其回復為野生型堿基(Flt3-ITD c.2076T)，在分別轉(zhuǎn)化了Ba/F3細胞系之后檢測了細胞對Quazartinib(AC220)

6、、Sorafenib和Ponatinib的敏感性。與預期一致，我們發(fā)現(xiàn)，兩個編碼序列均可順利轉(zhuǎn)化Ba/F3細胞，均顯示了持續(xù)活化的激酶活性;與Flt3-ITD c.2076T相比，F(xiàn)lt3-ITD c.2076T＞A使得腫瘤細胞對Quazartinib和Sorafenib表現(xiàn)出耐藥，而兩株細胞對Ponatinib均敏感，與已有報道結(jié)果一致。該實驗證實了，F(xiàn)lt3-ITD敲入小鼠中發(fā)現(xiàn)的變異與人類白血病細胞FLT3中出現(xiàn)的Gate-kee