分子生物學基本技術(shù)在腫瘤研究中的應用

1、分子生物學基本技術(shù)在腫瘤研究中的應用分子生物學基本技術(shù)在腫瘤研究中的應用DNA重組技術(shù)（或基因工程）是20世紀生物學的偉大成就，并已滲透到生命科學包括醫(yī)學各個領域，為腫瘤的實驗研究和臨床診斷及治療提供了嶄新的技術(shù)和有用的工具。本附錄扼要介紹在分子腫瘤學領域中常用的分子生物學基本技術(shù)及其在腫瘤研究中的應用，著重介紹它們的原理和應用。至于具體的技術(shù)方法和操作步驟可參閱《分子克隆實驗指南》（第二版，科學出版社，1992年）等實驗指導。一、常用

2、的分子生物學基本技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核

3、酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。固相雜交固相雜交（solidphasehybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。斑步雜交（dothybridization）是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜

4、上然后加入過量的標記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡單，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；根據(jù)斑點雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。印跡雜交（blottinghybridization）Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單

5、鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對應結(jié)構(gòu)的已標記的探針進行那時交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色，檢測特定大小分子的含量?？蛇M行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析（RELP）等。Nthern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基中特定mRNA分子的

6、量與大小。該法是研究基因表達常用的方法，可推臬出癌基因的表達程度。該法的優(yōu)點是特異性高，可精確定位；能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完整地保持組織與細胞的形態(tài)。因此被廣泛應用于醫(yī)學生物學的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。DNA分子克隆技術(shù)（也稱基因克隆技術(shù)）

7、在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體（vecs）在細胞內(nèi)自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨

8、著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomiclibrary）另一種是cDNA庫。載體所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。細菌質(zhì)粒是一種細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為120kb，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。噬菌體（phaeg）噬菌體是感染細菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶

9、原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。黏性質(zhì)粒（cos）是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種46kb的環(huán)狀雜種DNA。表達型載體將上述細菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達型載體?；驇斓慕ㄔ旌心撤N生物體全部基歷的隨機片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過標記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩