分子生物學(xué)技術(shù)課件

1、分子生物學(xué)技術(shù),分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique,核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex) 。,一、分子雜交與印跡技術(shù)的原

2、理,（一）印跡技術(shù),利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。,用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,（二）探針技術(shù),二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用,（一）DNA印跡 (Southern blotting

3、),（二）RNA印跡 (Northern blotting),（三）蛋白質(zhì)的印跡 (Western blotting),用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。,用于RNA的定性定量分析。,用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。,其他：斑點印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)DNA點陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù) (DNA chip),三種印跡技術(shù)

4、的比較,分子雜交實驗,①,②,③,,,放射自顯影照片,DNA芯片技術(shù),PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用The Principle and Application of PCR Technology,,5?,Primer 1,,5?,Primer 2,,,,5?,5?,Template DNA,,一、PCR技術(shù)的工作原理,,,,,,,,,,,,,,PCR技術(shù)原理示意圖,PCR的基本反應(yīng)步驟,變性95?C,延伸72?C,退火Tm-5?C,,,

5、,,模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+,PCR體系基本組成成分,利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細(xì)胞的mRNA為模板獲得目的片段；利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中克隆基因。,二、PCR技術(shù)的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基

6、因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。,PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。,（三）DNA和RNA的微量分析,（二）基因突變,將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。,PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性 。,（四）DNA序列測定,（五）基因突變分析,逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse

7、 transcription PCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。RT-PCR是目前從組織或細(xì)胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),三、幾種重要的PCR衍生技術(shù),原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細(xì)胞涂片上的單個細(xì)胞內(nèi)進行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細(xì)胞中存在。原

8、位PCR方法彌補了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。,（二）原位PCR技術(shù),（三）實時PCR技術(shù),實時PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。,實時PCR技術(shù)原理,實時PCR分類：,圖20-3 TaqMan探針法實時PCR原理示意圖,基因文庫Gene Library,基因組DNA文庫 (genomic DNA

9、 library)cDNA文庫(cDNA library),基因文庫(gene library),是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。,一、基因組DNA文庫,基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。,用于構(gòu)建基因組文庫的載體有?噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。,基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選,第一輪篩選,第二輪篩選,第三輪篩選,基因組文庫篩選結(jié)果舉例

10、,cDNA文庫是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達信息。,二、cDNA文庫,生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique,是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，

11、從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNA microarray)。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),基因芯片工作流程示意圖,是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。,二、蛋白質(zhì)芯片,蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng),蛋白質(zhì)芯片(protein chip),蛋白質(zhì)芯片作用原理,生物大分子相互作用研究

12、技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù),酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選,常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù),標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。,（一）標(biāo)簽蛋白沉淀,標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分

13、子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。,標(biāo)簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖,（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途,酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用,證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選

14、未知的相互作用蛋白質(zhì)。,（三）免疫共沉淀技術(shù)的基本原理和用途,免疫沉淀（immunoprecipitation IP） 免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP） 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在

15、完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。CO-IP與質(zhì)譜分析 以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白,免疫沉淀原理圖解,免疫共沉淀原理圖解,免疫共沉淀原理圖解,蛋白A ， 蛋白B 抗A抗體C進行洗脫抗B抗體D進行驗證,CO-IP與質(zhì)譜分析流程,,電泳遷移率變動測定(electrophoretic mobility shift assa

16、y，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gel shift assay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。,二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù),（一）電泳遷移率變動測定,凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖,染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP

17、)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。,（二）染色質(zhì)免疫沉淀法,染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖,二、RNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù),RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP），是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。應(yīng)用范圍：研究蛋白與DNA動態(tài)作用研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達之間的關(guān)系研究蛋白與RNA的相互作用,激光共聚集顯微鏡

18、應(yīng)用技術(shù)Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM),激光經(jīng)放大、分光后由物鏡聚焦于焦平面上，同時，焦平面上被激光掃描的點F所發(fā)出的一定波長的熒光通過檢測針孔光欄達到檢測器，并成像于顯示器上，得到相應(yīng)的熒光圖象。,激光共聚焦顯微鏡工作原理示意圖,人眼及各類顯微鏡分辯率,人眼分辯率 0.20mm光學(xué)顯微鏡分辯率 0.25um共焦顯微鏡分辯率

19、 0.18um電子顯微鏡分辯率 0.20nm激光共聚焦顯微鏡有四個熒光通道，一個透射光通道,激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用,定位、定量三維重組動態(tài)測量 ? 活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化 測量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) ?自由基的檢測 ?藥物進入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量 ?蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)