人可溶性4-1BB配體在畢氏酵母中的高效表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文人可溶性41BB配體在畢氏酵母中的高效表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究姓名：沈麗琴申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科血液學(xué)指導(dǎo)教師：張學(xué)光20030501△里整絲!：!呈!曼竺壟望墨壁墨些窶壟墨苧皇塑堂墊絲塑墮塞生壅塑墨分泌型表達(dá)載體pPICZaAs41BBL；SacI限制性內(nèi)切酶酶切使之線性化，再電轉(zhuǎn)化法將線性化的pPICZaAs4—1BBL質(zhì)粒導(dǎo)入畢氏酵母菌株GSll5，并以同源重組形式整合到酵母染色體的AOX位點(diǎn)，經(jīng)Zeoc

2、in抗性篩選陽(yáng)性克隆。同時(shí)，挑取陽(yáng)性克隆在含甲醇的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)，并分別于培養(yǎng)的第24h，48h，72h分別吸出酵母上清，離心后進(jìn)行IZ％SDSPAGE電泳和WesternBlotting分析鑒是s41BBL的表達(dá)情況，得到能在甲醇誘導(dǎo)下穩(wěn)定分泌rhs4一IBBL的基因工程菌GSll5一pPlCZOLA—s4—1BBL。應(yīng)用全自動(dòng)發(fā)酵裝置進(jìn)行發(fā)酵，經(jīng)陰離子交換層析方法分離、純化，獲得純度達(dá)95％以上，分子量約21Kda的rhs41BB

3、L重組蛋白，紫外分光光度儀定量其最高表達(dá)量達(dá)：25ug／ml。二重組人可溶性41BB配體(rhs4一IBBL)的生物學(xué)功能探討1rhs41BBL刺激T細(xì)胞特性的研究T細(xì)胞的活化需要雙重信號(hào)，即除Ag一刪C復(fù)合物提供的特異性抗原刺激信號(hào)外，還需要非抗原特異的和非MHC限制的共刺激信號(hào)，T細(xì)胞只有獲得這二個(gè)信號(hào)后，才能發(fā)生有效的活化、增殖，進(jìn)而發(fā)揮其效應(yīng)功能，如分泌細(xì)胞因子或細(xì)胞毒性T細(xì)胞(crL)的溶細(xì)胞效應(yīng)。若無(wú)第一信號(hào)，可導(dǎo)致T細(xì)胞失

4、活和死亡。同樣若缺乏共刺激信號(hào)，T細(xì)胞將進(jìn)入無(wú)反應(yīng)狀態(tài)，甚至發(fā)生凋亡?；罨疶淋巴細(xì)胞在宿主防御病毒感染、抗腫瘤和移植排斥中發(fā)揮重要作用，并參與自身免疫病的發(fā)展過(guò)程。因此，41BB／4一IBBL協(xié)同刺激信號(hào)對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)和功能介導(dǎo)起著極其重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：(1)純化T細(xì)胞經(jīng)CD3激發(fā)型單抗刺激后12h，細(xì)胞呈現(xiàn)活化狀態(tài)，顯微鏡下觀察細(xì)胞增大增多，逐漸成團(tuán)生長(zhǎng)，T細(xì)胞表面41BB分子開(kāi)始表達(dá)，約48h達(dá)活化高峰，4IBB分子表